ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה תלת מימדי התרבות לנתח המורפולוגיה של ראשי תאים סרטניים בשד, כמו גם כדי לחקור את יחסי הגומלין ישירים ועקיפים ומונוציטים לבין התוצאות כגון קולגן השפלה, גיוס תאים חיסוניים, תא הפלישה, קידום של דלקת הקשורים לסרטן.
Abstract
מוטבע על מטריצה חוץ-תאית (ECM), תאים אפיתל רגיל ואמצעים בצורה אינטימית לתקשר עם תאים hematopoietic ו- hematopoietic, ובכך מאוד המשפיעים על התוצאה הומאוסטזיס ומחלות הרקמות. סרטן השד, הקשורים מקרופאגים (תאמי) משחק תפקיד קריטי התקדמות המחלה, גרורות, הישנות; לכן, הבנת המנגנונים של מונוציט chemoattraction כדי microenvironment את הגידול ואת האינטראקציות שלהם עם תאים סרטניים חשוב לשלוט במחלה. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של מערכת תלת מימדי (3D) תרבות משותפת של תאים סרטניים (BrC) בשד האנושי ומונוציטים אנושי. BrC התאים המיוצרים הבזליים רמות גבוהות של הפעלת מוסדר, T-cell נורמלי הביע והוא מופרש (RANTES), מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1), ופקטור המושבה-מגרה גרנולוציט-מקרופאג (G-CSF), בעוד תרבות משותפת עם ומונוציטים, בטא אינטרלויקין (IL)-1 ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β) ו- IL-8 היו מועשר יחד עם מטריקס metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2 ו- MMP-10. Microenvironment משתית את הגידול קידם התנגדות anoikis MCF-10A מבנים דמויי acini 3D, chemoattraction של monocytes ופלישה של תאים BrC אגרסיבי. הפרוטוקולים המובאת כאן חלופה נוספת במחיר נוח ללמוד תקשורת אינטרה-הגידול, הן דוגמה הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור תכונות ספציפיות של הגידול הביולוגיה הקשורים הגידול התוקפנות.
Introduction
הגידול ביולוגיה היא הרבה יותר מסובכים ממה שסברו קודם לכן. הרכבה ראיות מראה כי תאים סרטניים הם יותר מאשר גרידא בתפזורת של תאים מתרבים לא מבוקרת; במקום זאת, נראה תאים אמצעים שונים כדי לבצע פונקציות שונות הצגת הארגון גבוהה וההיררכיה בתוך הגידול1. תאים סרטניים נמצאים גם תקשורת אינטימית עם תאים שאינם טרנספורמציה: מקרופאגים, fibroblasts, לימפוציטים, adipocytes, תאי אנדותל, בין שאר התאים כולם שקועים חלבונים לגרדום, פוליסכרידים המהווים את ECM. אינטראקציות ישיר ועקיף רבים נוצרים בין תאים טרנספורמציה והפך הלא ועם ה-ECM, אשר משפיעה על המחלה תסריט2,3. בחוזקה. במקרה הספציפי של BrC, זה חשוב במיוחד לנתח את התקשורת של תאים BrC עם תאמי, בהתחשב בעובדה כי תאמי נמצאו לשחק תפקיד קריטי באבולוציה של הגידול, הגדלת הסיכון של גרורות, של הישנות המחלה4 ,5.
כדי לנתח אינטראקציות אינטרה-tumoral ותוצאות אפשריות שלהם, גישות חדשות 3D במבחנה פותחו בהתבסס על השימוש של תמציות ECM המספקים microenvironment הרבה יותר מורכב, יותר קרוב למציאות של הגידול ביולוגיה, לעומת תרביות תאים חד שכבתי קונבנציונלי שבו התאים גדלים קשור פלסטיק. פיטרסון, Bissell6 מסופקים הדגם הראשון של nonmalignant, ממאירים בתאי אפיתל החלב תרבותי על קרום המרתף laminin עשיר והיו הראשונים לתאר את המבנים 3D organotypic כי להפלות אדם nonmalignant תאים אפיתל בשד מהקבצים המקבילים ממאיר. עשור לאחר מכן, המודל שפותח על ידי Debnath, Muthuswamy, וסיפק Brugge-7,–8,–9 כלי חשוב להבהיר המסלולים ביולוגי נחשף במהלך שינוי ממאיר של הבלוטות acini, כזה כמו היווצרות acini גדולים עקב התפשטות בלתי מבוקרת, delocalization של חלבונים צומת חזק כמו עדות קיטוב תא לקוי וירידה acini לומן בשל התנגדות תא anoikis, סוג של מוות תאים מתוכנת המתרחשת ב anchorage תלוית תאים כאשר הם להתנתק מהתכונה ECM שמסביב. הדגמים של Sameni, Jedeszko, סלואן התמקדו פעילות הפרוטאוליטי הדמיה על ידי תאים, אשר קשורה קשר הדוק invasiveness, עוד תכונה קריטית של גידול ממאיר10,11,12. מודלים אלה מסתמכים על מטריצות חלבון מעורבב עם חלבונים שונים מתרצה-קרינה פלואורסצנטית מצעים (DQ-ג’לטין, DQ-קולגן, DQ-קולגן הרביעי), באותות פלואורסצנט אשר מעידים על השפלה הפרוטאוליטי של קולגן. דגמי תלת-ממד משמשים גם ללמוד מאפייני תא גזע של שניהם טרנספורמציה ו תאים סרטניים, אשר תא אגרגטים, הנקרא גם spheroids, יכול להיות בתרבית ההשעיה או בחלבונים ECM כמו חוקר על מנגנונים תאית התמיינות, א-סימטרי חלוקת התא, הדבקות לתא ו תא תנועתיות13,14. הפלישה מבחני לאפשר בדיקה של התוקפנות מהותי של הגידול וזיהוי של מולקולות זה לשמש chemoattractants במהלך תהליך פולשני ה-15. באופן כללי, תלת-ממד מודלים מייצגים של גיוון סבירים במבחנה תרבית תאים המשקפים באופן הדוק יותר רקמה נורמלית ולא oncogenic מורפוגנזה.
עיצבנו מערכת תרבות משותפת תא 3D המבוססת על מודלים הנ ל7,10,11, באמצעות שני האדם מסחרי BrC שורות תאים של פוטנציאל תוקפני ידוע (סוגי luminal, טריפל-שלילי), ראשי תאים explanted מחולים BrC. לראשונה פיתחנו מודל איפה כוחניות (MCF-7) או תאים (מד א-MB-231) BrC אגרסיבי היו בתרבית במשותף עם U937 ומונוציטים ב תמצית מטריצה חוץ-תאית (ECME)-מערכת תלת-ממד שמותר באינטראקציה ישירה תאים תאים מבוססת. תרבויות שיתוף אלה שימשו כדי לקבוע כיצד התקשורת בין שושלות תא שני אלה השפיעו על שעתוק של קבוצת גנים הקשורים לסרטן התנהגות תוקפנית. עלייה משמעותית של cyclooxygenase-2 (COX-2) תעתיק נצפתה כי בד בבד עם ייצור מוגבר של אחד המוצרים שלה, פרוסטגלנדין E2 (PGE2), ממצא זה הדגיש את תפקידה של דלקת התקדמות סרטן. שעתוק מוגברת של MMP נצפתה גם זה בקורלציה עם proteolysis קולגן רבתי כאשר תאים מד א-MB-231 אגרסיבי היו תרבותי משותף עם U937 ומונוציטים בתרבויות המכילות קולגן DQ הרביעי. ראוי לציין, תרבויות המשנה שלנו לא תמכו ההנחה כי מנגנוני אינטראקציה עם תא-תא יש צורך קולגן השפלה. זה די הציע כי התקשורת בין שושלות תא שני היה מתווך על ידי מולקולות המופרש. יתר על כן, supernatants שנקטפו מבחני תרבות שיתוף אלה הכילו גורמים מסיסים מאורגן acini הבלוטות הנוצרת על-ידי שאינם הפך MCF-10A תאים13. נמצא כי אגרסיבי, תאים BrC הראשי מופרש רמות גבוהות של מונוציט chemotactic מולקולות MCP-1, GM-CSF ולאחר RANTES. לפיכך, אנו המתוארים תרבות 3D שבו תאים הופרדו תא מוסיף תרבות כדי למנוע תא-תא אינטראקציות. תרבויות אלה שימשו כדי לטפל התקשורת עקיף בין תאים BrC ומונוציטים. אלה מבחני, כוחניות ותוקפנית מסחרי BrC שורות תאים, התאים BrC הראשי של שלושה סוגים שונים של האדם ומונוציטים: U937 מסחרי ותאי THP-1, ומונוציטים הראשי (PMs) מבודד מהדם ההיקפי של תורמים בריא (כל ומונוציטים שימשו במצב שלא הופעל) שימשו. ריכוז מוגבר של ציטוקינים דלקתיים IL-1β ו- IL-8 נצפו כדי להעשיר בתרבות משותף. בדומה לכך, נמצא כי MMP-1, MMP-2 ו- MMP-10 היו גם גדל ב BrC תאים-מונוציט תרבויות המשנה, ובכך חיזוק הממצאים הקודמים14. כתב יד זה, זרימת עבודה-מדוקדק של ראשי בידוד תאים BrC ובדיקה בתרבויות 3D מוצגת יחד עם נציג תוצאות. עבודה זו מהווה דוגמה טובה של הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור היבטים ספציפיים של הגידול הביולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים אפיתל לגדול קונפורמציה מרחבית תלת-ממד, האינטראקציה שלהם עם החלבונים ECM מכריע בשביל לרקמות הומאוסטזיס. מחקרים סרטן רבים התבססו על התאים גדלו ב monolayers (2D), למרות שהם כבר קריטי להבנת היבטים רבים של היווצרות הגידול והתקדמות, monolayers לא מסכם את הדברים המאפיינים שמטילה על תאים, ECM עבור מופע: הגב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי CONACyT FONSEC הסוכן המיוחד/איאמאסאס/ISSSTE פרויקט מס 233061 כדי Ezequiel מ פואנטס-Pananá ועל ידי Fondo Apoyo דה לה Investigación, בית החולים הקניות de México פדריקו גומז (פרויקט מספר לו-2014-053). נה אספינוזה-Sánchez הוא דוקטורנט מן פרוגרמה de Doctorado en Biomédicas עצמה, למד נאסיונאל Autónoma de México (UNAM) ואחווה שהתקבלו 231663 מ- CONACYT. נה E-S, גם להכיר את התמיכה הכספית שסופקו על-ידי המכון המקסיקני של ביטוח לאומי (איאמאסאס).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
Referências
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
