Das Ziel dieser Studie war es, in-vitro- Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen Modulation der Morphologie der Cholesterin-Partikel zu bewerten. Vergleich der Lipidsenker ergab Variationen in ihrer Wirkung Modulation der morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel.
Behandlung von Dyslipidämie Patienten mit lipidsenkenden Medikamenten führt zu einem deutlichen Rückgang der Low-Density-Lipoproteine (LDL) Ebene und eine geringe bis mäßige Niveau der Anstieg des High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterins im Plasma. Allerdings ist eine mögliche Rolle dieser Medikamente bei Veränderung der Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die in-vitro- Bewertung der lipidsenkenden Drogenwirkungen Modulation morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel mit der Plaque-Array-Methode in Kombination mit bildgebenden Durchflusszytometrie. Bild-Analysen der Cholesterin-Partikel angedeutet, dass Lovastatin, Simvastatin, Ezetimib und Atorvastatin die Bildung von Kugelsternhaufen und linearen Strang geformt Partikel induzieren, veranlaßt Niacin, Fibrate, Fluvastatin und Rosuvastatin das Bildung von nur kugelig geformten Partikeln. Nächste, gereinigte sehr Low density Lipoprotein (VLDL) und LDL-Partikel, die mit diesen Medikamenten inkubiert zeigten Veränderungen in der Morphologie und Image Textur des Cholesterins Partikel Subpopulationen. Screening von 50 Serumproben ergab darüber hinaus die Anwesenheit von ein höheres Maß an lineare geformte HDL-Cholesterin-Partikel bei Patienten mit Dyslipidämie (Mittelwert von 18,3 %) im Vergleich zu den Beispielen Alter abgestimmt Normal (Mittelwert von 11,1 %). Wir beobachten auch, dass erhebliche Unterschiede in Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen auf die Verringerung der linearen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben geformt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Lipidsenker, neben ihrer Zell-vermittelten lipidsenkende Wirkung, Morphologie der Cholesterin-Partikel direkt von einem nicht-enzymatische Wirkmechanismus modulieren können. Die Ergebnisse dieser Ergebnisse haben Potenzial, Diagnose der Atherosklerose zu informieren und optimalen lipidsenkenden Therapie vorherzusagen.
Zahlreiche klinische Studien haben bewiesen, wohltuende Wirkung der Lipid-senkende Medikamente bei der Verringerung der Plasmaspiegel von Low-Density-Lipoproteine (LDL) Cholesterin und einem niedrigen bis moderaten Anstieg der High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin, die primäre und sekundäre Vorfälle im Zusammenhang mit Arteriosklerose kardiovaskuläre Nebenwirkungen1,2,3,4,5verhindert. Statine, eine Gruppe von HMG-CoA-Reduktase-Enzym-Inhibitoren, blockieren die körpereigene Cholesterinsynthese in der Leber, dass wiederum führen zu niedrigeren Niveaus von LDL-Cholesterin im Blut6,7im Umlauf. Ebenso ist die Senkung der Wirkung von Niacin Lipid durch seine direkte und nichtkompetitiv Hemmung der Hepatozyten Diacylglycerol Acyltransferase-2, ein Schlüsselenzym Leber beteiligt Triglycerid-Synthese8vermittelt. Vergleichsweise, reduziert Ezetimib Plasmaspiegel von LDL durch die Absorption der exogene Cholesterin durch die Bindung an Niemann-Pick-C1-Like-1 (NPC1L1) Protein befindet sich in den Epithelzellen des Dünndarms9Begrenzung. Fenofibrate, einem anderen Lipid-senkenden Medikament, reduziert deutlich die Plasmakonzentrationen von Triglyceriden und LDL-Cholesterin durch das Peroxisom davon aktiviert Rezeptoren Weg10auch mäßig verringert. Außerdem ist Omega-3-Fettsäure berichtet, um die Anti-atherosklerotische Wirkung wegen seiner Fähigkeit, die Plasmaspiegel von LDL11zu senken.
Lipidsenker, neben ihrer primären Effekt auf die Senkung des LDL-Cholesterins, haben eine Reihe von vorteilhaften pleiotrope Effekte einschließlich Erhöhung der HDL, Verbesserung der endotheliale Funktionen, Verringerung der Entzündung und Hemmung der Thrombozyten Aggregationen12,13,14. Aber der zugrunde liegende Mechanismus dieser Medikamente bei Erhöhung der HDL-Cholesterin-Partikel und ändern ihre strukturellen Merkmale sind nicht vollständig geklärt. Da diese Medikamente häufig zur Behandlung von Atherosklerose-Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) vorgeschrieben sind, gilt es weiter zu untersuchen, ihre mögliche Rolle bei der Bestimmung der morphologischen Merkmale und Verteilung der Lipid-Partikel. Die menschlichen Plasma-Lipidome besteht aus etwa 600 verschiedene Lipide und 22 verschiedenen molekularen Arten von Lipoproteinen, die in verschiedenen Größen, Formen, dichten und Kompositionen15,16,17 . Analytische Methoden wie Ultra-Zentrifugation, NMR und Gradienten Gelelektrophorese werden verwendet, um LDL und HDL-Partikel und ihre Unterfraktionen18,19charakterisieren. Jedoch beschränkt sich die Anwendung dieser Methoden auf Studien zur Bestimmung der Wirkung von Drogen in der modulierenden Morphologie und Montage der Lipid-Partikel. Flow Cytometer basierend Plaque Array ist eine funktionelle biochemischen Assays entwickelt, für die Erkennung und Visualisierung von Serum Lipid und Amyloid Plakette Partikel20abgeleitet. Die Vorteile von in-vitro- bildgebendes Verfahren, die in dieser Studie beschriebenen ermöglicht die Identifizierung von Lipid-modulierende Drogenwirkungen Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel im Puffer und Serumproben zu ändern.
Im Allgemeinen sind die Verteilung und die funktionellen Eigenschaften der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel in den Blutkreislauf hauptsächlich durch metabolische, genetische, epidemiologischen, Mobilfunk und Plasma Faktoren22,23bestimmt. In der vorliegenden Studie untersucht die Auswirkungen der Lipid-modifizierende Drogen im Puffer ergab, dass hoch lipophile Drogen wie Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Atorvastatin eine höhere Ebene Komplexität auf die Morphologie der Cholesterin-Partikel induziert im Vergleich zu der unteren Ebene Wirkung mit hoch hydrophilen Rosuvastatin und Fluvastatin Drogen beobachtet. Diese Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit unseren früheren Studie beschreibt eine nicht-enzymatische Mechanismus Wirkung von Statinen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in den Puffer und Serum Proben21Modulation. Dementsprechend zeigten die Ergebnisse aus dieser Studie ein nicht-enzymatische Wirkmechanismus von Ezetimib, Niacin, fibrate, und Omega-3-Fettsäure-Drogen, die eine direkte Rolle bei der Modulation der Cholesterin-Partikel-Bildung spielen können. Es ist möglich, dass die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Cholesterin Aggregate führt bis zur Montage von Großformat-Cholesterin-Partikel, die 2-60 µm2, sind kugelförmig und linearen Strang Morphologien ausstellen.
Außerdem empfehlen die erzielten Ergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel Wechselwirkungen zwischen Cholesterin Aggregate und Plasma Faktoren einschließlich VLDL, LDL und HDL Proteine, die die Kompositionen und die morphologischen Eigenschaften des Cholesterins verändern kann Partikel. Die Droge Behandlungsergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel zeigten eine höhere Ebene Drogenwirkung auf VLDL-Partikel-Bildung im Vergleich zu ihrer Wirkung auf LDL-Cholesterin-Partikel-Bildung beobachtet. Die Lovastatin, Simvastatin und Ezetimib Medikamente dienten als Pro-Drogen und ihre Dosen in den Tests können höher sein als die physiologischen Konzentrationen.
Interessant, geformte screening von Serumproben zeigte Variationen der Drogenwirkung auf die Profile der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel-Bildung zu verändern, insbesondere deren Auswirkungen auf die Formationen der lineare LDL und HDL-Partikel. Diese Medikamente induzierte Reduktion auf lineare geformte LDL und HDL Cholesterin Partikel Bildung in Dyslipidämie und normalen Serumproben Alter abgestimmt. Die Arzneimittelwirkungen beobachtet auf die Verringerung der linear geformten Partikeln Bildung lag in Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin. Die Identifizierung von Cholesterin-Partikel mit kugelförmigen und linearen Strang Morphologien in Normal und Dyslipidämie Serumproben deutet darauf hin, dass Teilchen mit ähnlichen Morphologien in in Vivo Bedingungen bilden können. Frühere Studien haben das Vorhandensein von Scheibe und nadelartige Cholesterin-Kristalle in den atherosklerotischen Plaques Menschen- und ApoE– / – und LDLR– / – Mäusen Modelle24,25,26 identifiziert. ,27,28.
Die HDL-Partikel im Blut zirkulierenden vorhanden sein, da eine heterogene Mischung und das Niveau der klein und groß HDL-Partikel sowie funktionelle Aktivität wichtige Faktoren sind, die ihre Herz-Kreislauf-Schutz wirken über den umgekehrten Cholesterin-transport Weg29,30. Jüngste Studien haben deutlich gemacht, dass die Bedeutung der Identifizierung von HDL-Cholesterin Partikel Unterfraktionen für die Aufklärung ihrer Rolle in mehrere biologische Funktionen wie Cholesterin Efflux, entzündungshemmende, Anti-thrombotische und anti-oxidativen31 . Darüber hinaus haben eine Reihe von Studien die Wirkung der lipidsenkenden Therapie bei der Steigerung von eines niedrigen Niveau von HDL im Plasma1,5,21moderieren berichtet. Entsprechend liefern der Ergebnisse aus dieser Studie neue Erkenntnisse auf morphologische Merkmale der Cholesterin-Partikel. Insbesondere die Erkennung von einer höheren Ebene linear geformten HDL Cholesterin-Partikel in Serumproben von Dyslipidämie Themen legt nahe, dass sie die verlässliche Biomarker für die Diagnose und Bewertung der Auswirkungen der Lipid-modifizierende möglicherweise Drogen bei Patienten. Weitere ist Untersuchung jedoch erforderlich, mit großen klinischen Proben, um die Cholesterin-Partikel mit verschiedenen Morphologien und deren Zuordnung zu CVD besser zu verstehen.
In der Plaque Array Assays für die Prüfung der Drogenwirkung auf Montage von Cholesterin-Partikel, verwendeten wir 2 µg der Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin Aggregate und 5 µgof Droge, weil: (1) Drogen kompetitiv an beiden Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin binden und endogene Lipide in die Serumproben vorhanden; (2) von jeder Probe erwarben wir 5.000 bis 10.000 Cholesterin-Partikel, die in großen Größen und Formen von ~ 2-60 µ2montiert werden; (3) Wir beobachteten eine große Unterschiede der Droge Reaktion zwischen Serumproben inkubiert mit Drogen (Dosen 300 ng zu 5 µg) und ~ 1-5 % von ihnen inkubiert mit hohen Dosen zeigten keine nachweisbaren Änderungen im Profil der Cholesterin-Partikel-Bildung; und (4) die Interaktion zwischen Cholesterin Aggregate und Lipidsenker wird durch ein nicht-enzymatische Prozess vermittelt. Daher können die Konzentrationen der im Test verwendeten Reagenzien höher als ihre physiologischen Ebene sein.
Zusammenfassend haben wir erfolgreich demonstriert die Vorteile einer in-vitro- bildgebendes Verfahren beschrieben in dieser Studie zur Bestimmung der Wirkung eines breiten Spektrums von lipidsenkenden Medikamenten auf modulierenden Morphologie und Zusammensetzung des Cholesterins Partikel. Der Ansatz der Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie der Lipid-Teilchen durch den Einsatz einer Konstellation von Bild-Analyse-Algorithmen kann helfen, die Diagnose der Atherosklerose und Ergebnisse der lipidsenkenden Therapie bei Patienten zu bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch eine Plaxgen Forschung finanziert Stipendium an SM (PLX-1008). Wir danken für das Sammeln von Serumproben von Atherosklerose Untertanen unter Zustimmung der IRB Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |