שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה
Summary
כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.
Abstract
שיטה מתוארת עבור תיוג RNA שליח בודדים (mRNA) תעתיקים של חיידקים קבוע עבור שימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH מאפשר מדידת השתנות לתא במספר עותק ה-mRNA של הגנים של עניין, כמו גם המיקום subcellular של התרשימים. הצעדים העיקריים הכרוכים הינם קיבוע של התרבות תא החיידק, permeabilization של קרום התא, הכלאה של התרשימים היעד עם קבוצות של הגששים זמינים מסחרית oligonucleotide קצר עם התווית fluorescently. smFISH יכול לאפשר ההדמיה של התרשימים של גנים מרובים באותו התא, עם מגבלות שהוטלו על ידי ספקטרלי החפיפה בין סמנים שונה פלורסנט. בעקבות השלמת פרוטוקול מאויר להלן, תאים יכולים בקלות לדימות באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם מצלמה מתאימה פלורסצנטיות בעוצמה נמוכה. תמונות אלה, יחד עם קווי המתאר תא שהושג פילוח של שלב ניגודיות מסגרות, או קרום התא מכתים, לאפשר את החישוב של mRNA עותק מספר התפלגות דגימה של תאים באמצעות תוכנת קוד פתוח או שכתוב מותאמת אישית. שיטת תיוג המתוארים כאן גם יסייע לי תמונה תעתיקים עם מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה).
Introduction
Stochasticity הוא היבט היסוד, נמנע של ביטוי גנים ונותן עלייה לתא-תא הטרוגניות1, שניהם ברמה של תעתיקים, חלבונים2,3. לכימות ההשתנות בין תאים בתנאים מוגדרים היטב מציעה חלון ייחודי תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס ביטוי ובקרת גנים שלה. מקור חשוב אחד של תא-תא הטרוגניות של חיידקים מתרחש ברמת תעתיק. התעתיק מספרי משתנים לא רק בשל את stochasticity של שעתוק, אלא גם לתהליכים post-transcriptional כגון רגולציה על ידי קטן RNAs ו RNAases2. דרך אחת של גישה ישירה זו הטרוגניות בצורה כמותית היא על-ידי תיוג fluorescently בודדים תעתיקים של גן מסוים ב- smFISH. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי ולוקליזציה subcellular של מולקולות RNA מסוים בתוך תיקנו, תאים חיידקיים בודדים4. mRNAs הם hybridized עם קבוצה של fluorescently-ידי ~ 20 בסיס באורך oligonucleotides שנועדו לאגד באופן סלקטיבי תעתיקים של ריבית5,6. תיוג מרובים מבטיחה זיהוי מעל רקע זריחה, מולקולות mRNA בודדות מופיעות נקודות עקיפה-מוגבלת תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות7 (ראה איור 1). ישנן גישות אחרות עבור תיוג מולקולות mRNA, שבו הגששים אוליגומר משלימים לשאת haptens מצומדת (למשל, ביוטין או digoxigenin) שזוהו באמצעות טכניקות משני כתב שכותרתו fluorescently8.
ישנן שיטות אחרות המספקים מידע כמותי אודות תעתיקים, בנוסף smFISH. כמה כמו הצפוני כתם או בדיקה הנפח PCR כמותי, ובכך יכול למדוד את מספר העותקים mRNA לא ולא עמדתם בתאים בודדים. לכן שיטות אלה אינם מתאימים לכמת השתנות מתא לתא. המערכת פותחה טכניקה המבוססת על תמונה האחרונות מאפשר כימות של הן מספר עותק RNAs בתוך התאים, כמו גם המיקום תאיים שלהם, שנקרא מרובב פלורסצנטיות שגיאה-חזקה בחיי עיר הכלאה (MERFISH). MERFISH מבוסס על ההקצאה של ברקוד ייחודי המורכב שילוב מוגדר של מספר קבוע של הגששים שכותרתו fluorescently oligonucleotide. ברקודים אלה נקראים סיבובים רציפים של מדידות smFISH, עם photobleaching הבאים בכל סיבוב של הכלאה, ובכך מגדיל את התפוקה על-ידי שני סדרי גודל9,10. טכניקה זו מחייבת של נוזל אוטומטיות טיפול המערכת ואת העיצוב המתאים של ערכת בדיקה.
השילוב של קרינה פלואורסצנטית מרובים תיוג של תעתיקים בודדים, יחד עם טכניקות הרומן סופר-רזולוציה כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)11, מאפשר גידול ten-fold רזולוציה לוקליזציה subcellular של הפרוטוקולים. בסערה, שילוב מתאים של הגששים פלורסנט ומאגר הדמיה מאפשר מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית לכל מולקולה בדיקה (מהבהב). הסערה עשוי לשמש גם תמונה של e. coli transcriptome ולבחון את הגנום כולו הארגון המרחבי של RNA, על-ידי תיוג בו זמנית כל התרשימים של ריבית12.
כל השיטות בתא יחיד שנסקרו לעיל מבוססים על הדמיה תעתיקים בתאים קבוע. לפיכך, הם אינם מספקים מידע כלשהו בדבר המאפיינים קינטי של תעתיקים בתוך התאים. לעקוב תעתיקים תאים חיים13, mRNAs יכול להיקרא על ידי היתוך גרעיני של הגן עניין למערך של איגוד אתרים. ואלו מכן מוכרות על ידי מחייב RNA חלבון, כמו bacteriophage MS2 המעיל חלבון, אשר היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי כגון ה14,10,חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)15.
כאן נתאר שיטת תיוג mRNAs בודדים עם סט של הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים smFISH, בפרט ב e. coli. יתר על כן, אנו מראים כי שיטת תיוג אותו עשוי לשמש למדידות סערה עם שינויים מזעריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לנו יש למדוד במעבדה שלנו המספר תעתיק של גנים שונים ב e. coli תאים באמצעות שיטת smFISH2. בקצרה, ההליך מורכב מהשלבים הבאים: תא קיבעון, permeabilization של ממברנות כדי לאפשר חדירה בדיקה, בדיקה הכלאה, וטעמו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה. נוהל זה מבוסס על אלה שפורסמו בעבר ע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדעים 514415 (ל. י. ס) ו- BSF-NSF (MCB) מענק 2016707 (ס). תומך זיגפריד, אירמה אולמן הלימודית הכסא (ס) הוא גם הודה.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
Referências
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda, ., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence “Turn-On” Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
