Denne protokollen beskriver en metode for å bestemme protein halv-bor i enkelt levende tilhenger celler, puls merking og fluorescens tidsinnstilt bildebehandling SNAPIN-tag fusion proteiner.
Proteiner er i en dynamisk tilstand av syntese og nedbrytning og halv-livet kan justeres i ulike situasjoner. Men mest brukte tilnærminger til å bestemme protein half-life er begrenset til befolkningen gjennomsnitt fra lysed celler eller krever bruk av protein syntese hemmere. Denne protokollen beskriver en metode for å måle protein halv-bor i enkelt levende tilhenger celler, bruke SNAPIN-tag fusion proteiner i kombinasjon med fluorescens time-lapse mikroskopi. Noen protein rundt smeltet sammen til en SNAPIN-kode kan bindes covalently av et lysstoffrør, celle permeable fargestoff som er koblet til en benzylguanine derivat, og forfallet av befolkningen merket protein kan overvåkes etter bleke av gjenværende fargestoffet. Etterfølgende cellen sporing og kvantifisering av integrert fluorescens intensiteten over tid resultater i en eksponensiell decay kurve for hver merkede celle, slik at bfu protein fornedrelse i enkeltceller ved montering kurve. Denne metoden gir et estimat for mangfold i halv-bor i en befolkning på kulturperler celler, som ikke kan lett bli vurdert av andre metoder. Tilnærmingen presenteres her gjelder alle typer kulturperler tilhenger celler som uttrykker et protein rundt smeltet sammen til en SNAPIN-kode. Her bruker vi musen embryonic stem (ES) celler dyrket på E-cadherin-belagt celle kultur plater for å illustrere hvordan enkelt celle fornedrelse priser proteiner med et bredt spekter av halveringstid kan bestemmes.
Det er velkjent at mobilnettet proteiner gjennomgår omfattende omsetning, syntese og nedbrytning priser blir bestemt for hver protein med fysiologiske regulering. Protein fornedrelse priser har tradisjonelt vært målt med bulk metoder som radioaktivt puls chase analyse, eller involverer protein syntese hemmere som gapestokk1. Flere nylig, stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) i kombinasjon med massespektrometri er etablert for å kvantifisere protein omsetning på en global skala2. Men disse metodene er begrenset av befolkningen gjennomsnitt, og informasjon om celle-til-celle variasjon er derfor tapt. Videre kan ikke forbigående endringer i protein fornedrelse som er usynkronsierte over befolkningen cellen identifiseres.
Alternativt kan protein halv-liv også fastslås ved fluorescens-baserte tilnærminger, som ofte har fordelen av å gi encellede oppløsning. For eksempel har et photoactivatable grønne fluorescerende protein (paGFP) blitt brukt til å bestemme Oct4 half-life i tidlige pattedyr embryoet3. En annen metoden å overvåke protein forfall i levende celler er bruken av en SNAPIN-kode i kombinasjon med fluorescens tidsinnstilt bildebehandling. SNAPIN-koden er en mutert versjon av DNA reparasjon enzym O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) som spesielt reagerer med benzylguanine (BG) derivater, som kan kobles til molekylær sonder4,5, 6. derfor alle SNAPIN-tag fusion protein kan bli irreversibelt merket med et fluorescerende, celle permeable fargestoff. Puls merking av et protein rundt smeltet i SNAPIN-koden, etterfulgt av bleke den gjenværende fargestoff, tillater for overvåking nedbrytning av befolkningen merket protein og dermed for å bestemme protein half-life. SNAPIN-koder har blitt brukt for puls-jage merking av proteiner og for å bestemme protein halv-bor i tilhenger celle kultur og i vivo5,7,8,9. Et stort utvalg av SNAPIN-tag underlag dekker brukte lysstoffrør spectra er kommersielt tilgjengelig, slik at utvalget av optimal farge for hvert bruksområde. Dermed kan SNAPIN-koder også brukes for multicolor bildebehandling i kombinasjon med andre fluorescerende fusion proteiner eller fargestoffer. Celle-ugjennomtrengelig fargestoffer er egnet for merking av membran-bundet proteiner, mens celle-permeable fargestoffer gjelder for overvåking av både intracellulær og membran-bundet proteiner. Videre noen av disse sonder exhibit nesten ingen basale fluorescens og bare starte utsendt et sterkt fluorescerende signal ved binding til en SNAPIN-tag10.
Denne protokollen beskriver hvordan du angir nedbrytning av ulike proteiner av interesse i enkeltceller benytter en SNAPIN-tag. Bruker her vi denne metoden musen embryonic stem (ES) celler kultivert på E-cadherin, men det bør være mulig å bruke den med en tilhenger kulturperler celle type. Vi viser at pulsen merking av SNAPIN-tag fusion proteiner etterfulgt av fluorescens tidsinnstilt bildebehandling kan bestemme enkeltcelle halv-livet av rundt og gir et estimat for celle til celle variasjon av halv-bor i en befolkningen i kulturperler celler.
Det mest avgjørende skrittet når benytter en SNAPIN-tag for å overvåke protein forfallet er å sikre at ingen gjenværende ubundet fargestoff står i medium eller i cellene etter vasking, ellers det kan binde til nylig produsert SNAPIN-tag molekyler senere i løpet av eksperimentet og der Eby kompromiss forfallet kurve. Dette er på den ene siden av nøye utfører alle trinnene som beskrives vask. På den annen side, bør fargestoff konsentrasjonen holdes så lavt som mulig, mens du fremdeles er i et område som gir …
The authors have nothing to disclose.
Time-lapse mikroskopi eksperimenter ble utført på den Biomolecular Screening anlegg (BSF), EPFL. Vi takker Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) for videography og redigering av filmen.
Equipment | |||
ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
Microsoft Excel | Microsoft | – |