Single-Cell kvantifiering av Protein nedbrytningshastigheten av Time-Lapse fluorescensmikroskopi i vidhäftande cellodling
Summary
Det här protokollet beskriver en metod för att bestämma protein halveringstider i enda levande vidhäftande celler, med hjälp av puls märkning och fluorescens time-lapse avbildning av SNAPIN-tag fusionsproteinerna.
Abstract
Proteiner är i ett dynamiskt tillstånd av syntes och nedbrytning och deras halveringstider kan justeras under olika omständigheter. Men vanligaste metoder för att bestämma protein halveringstid är antingen begränsat till befolkningen medelvärden från lyserat celler eller kräva användning av proteinhämmare syntes. Det här protokollet beskriver en metod att mäta protein halveringstider i enda levande vidhäftande celler, med hjälp av SNAPIN-tag fusionsproteinerna i kombination med time-lapse fluorescensmikroskopi. Något protein sevärdheter smält till en SNAPIN-tagg kan vara kovalent bundna av ett fluorescerande, cell genomsläpplig färgämne som är kopplat till ett benzylguanine derivat och sönderfallet av befolkningens märkta proteinet kan övervakas efter bortspolning av kvarvarande färgämnet. Efterföljande cell tracking och kvantifiering av integrerade fluorescensintensiteten över tid resulterar i en exponentiell förruttnelse kurva för varje spårad cell, vilket möjliggör att bestämma protein nedbrytningshastigheten i enstaka celler genom kurva montering. Denna metod ger en uppskattning för heterogena halveringstider i en population av odlade celler, som enkelt inte kan bedömas med andra metoder. Den strategi som presenteras här är tillämplig på alla typer av odlade vidhäftande celler som uttrycker ett protein av intresse smält till en SNAPIN-tagg. Här använder vi mus embryonala stamceller (ES) celler odlas på E-cadherin-coated cell kultur plattor för att illustrera hur enda cell nedbrytning priser av proteiner med ett brett spektrum av halveringstider kan bestämmas.
Introduction
Det är väl känt att cellproteiner genomgår omfattande omsättning, med syntes och nedbrytning priser att vara specifika för varje protein och fysiologiska regleras. Traditionellt varit protein nedbrytningshastigheten mätas med bulk metoder, såsom radioaktivt puls chase analys, eller berör proteinsyntes-hämmare såsom Kungliga Automobilklubben1. Mer nyligen, stabil isotop märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) i kombination med masspektrometri har fastställts för att kvantifiera protein omsättningen på en global skala2. Men dessa metoder är begränsade av befolkningen i genomsnitt och information om cell till cell variabilitet är därför förlorade. Dessutom kan inte övergående förändringar i proteinnedbrytning som är osynkroniserade i cell befolkningen identifieras.
Alternativt, protein halveringstider kan också bestämmas genom fluorescens-baserat tillvägagångssätt, som ofta har fördelen av att ge enskild cell lösning. En photoactivatable grönt fluorescerande protein (paGFP) har exempelvis använts för att fastställa Oct4 halveringstid i den tidiga däggdjur embryo3. En annan metod att övervaka protein förfall i levande celler är användningen av en SNAPIN-tagg i kombination med fluorescens time-lapse imaging. SNAPIN-taggen är en mutant version av DNA-reparation enzym O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) som reagerar specifikt med benzylguanine (BG) derivat, som kan kopplas till molekylär sonder4,5, 6. därför alla SNAPIN-tag fusionsprotein irreversibelt kan märkas med en fluorescerande, cell genomsläpplig färg. Pulse märkning av ett protein av intresse smält SNAPIN-etiketten, följt av bortspolning av kvarvarande färgämnet, tillåter för övervakning nedbrytningen av märkta proteinet befolkningen och därmed bestämma protein halveringstid. SNAPIN-Taggar har använts framgångsrikt för puls-chase märkning av proteiner och för att bestämma protein halveringstider i anhängare cell kultur och i vivo5,7,8,9. En stor mängd olika SNAPIN-tag substrat som täcker vanligen används fluorescerande spectra är kommersiellt tillgängliga, möjliggör val av optimal färgen för varje specifik applikation. SNAPIN-taggar kan således även användas för multicolor imaging i kombination med andra fluorescerande fusionsproteinerna eller färgämnen. Cell-impermeable färgämnen är lämplig för märkning av membran-bundna proteiner, cell-permeable färgämnen är tillämpliga för övervakning både intracellulära och membran-bundna proteiner. Dessutom några av dessa sonder uppvisar nästan ingen basala fluorescens och bara börja avger en stark fluorescerande signal vid bindning till en SNAPIN-tag10.
Det här protokollet beskriver hur man mäter nedbrytningshastigheten av olika proteiner av intresse i enstaka celler med hjälp av en SNAPIN-tagg. Vi tillämpa här denna metod på mus embryonala stamceller (ES) celler odlade på E-cadherin, men det bör vara möjligt att använda den med någon vidhäftande odlade celltyp. Vi visar att puls märkning av SNAPIN-tag fusionsproteinerna följt av fluorescens time-lapse imaging tillåter för att bestämma de enda cell halveringstid av olika proteiner av intresse och ger en uppskattning för cell till cell variabilityen av halveringstider i en befolkningen i odlade celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest avgörande steget när du använder en SNAPIN-tag för att övervaka protein förfall är att säkerställa att inga kvarvarande obundet färgämne är kvar på medellång eller i cellerna efter tvätt, inget annat det kan binda till nyligen producerade SNAPIN-tag molekyler senare i samband med experiment och ther Eby kompromiss decay kurvan. Detta är å ena sidan uppnås genom att noggrant utföra alla steg som beskrivs tvätt. Däremot, bör färgämne koncentrationen hållas så låg som möjligt, medan det …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Time-lapse mikroskopi experimenten utfördes på den Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Vi tackar Marc Delachaux (Service Audiovisual, EPFL) för videography och redigering av filmen.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
Referências
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
