면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포
Summary
종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.
Abstract
면역 세포 종양 microenvironment의 중요 한 구성 요소 이며 발암의 모든 단계에서 종양 성장과 진화에 영향. 특히, 그것 지금 잘 설립 인간의 종양에 면역 침투 예 후와 치료에 응답을 상호 연결할 수 있습니다. 종양 microenvironment에 면역 침투의 분석은 환자와 치료에 대 한 응답의 분류에 대 한 주요 도전 되고있다.
억제 수용 체 프로그램 세포 죽음 단백질 1 (PD1; 일컬어 CD279), 세포 독성 T 림프 구 관련 4 (CTLA-4) 단백질, T 세포 면역 글로불린 및 Mucin 포함 단백질-3 (팀 3, 일컬어 CD366), 림프 구 등의 공동 식 활성화 유전자 3 (지연-3, 일컬어 CD223), T 세포 소모의 특징 이다. 우리는 multiparametric 제자리에 면역 형광 식별 하 고 이러한 억제 수용 체의 공동 식 세포 수준에서 계량 얼룩을 개발 했다. 신장 세포 carcinomas (RCC)의 냉동된 조직의 회고전 시리즈, 이미지 분석 소프트웨어와 결합 된 형광 multispectral 이미징 기술을 사용 하 여, 종양 CD8 침투에 PD 1 팀 3의 공동 식 찾아냈다+ T 세포 RCC에서 가난한 예 후와 상관 된다. 하 우리의 지식,이 대표가 자동 멀티플렉스 현장 기술 시연 첫 번째 연구는 몇 가지 임상 관련성 있을 수 있습니다.
Introduction
지난 몇 년 동안, immunotherapy RCC를 포함 하 여 암의 많은 종류에 대 한 매우 유망 치료로 등장 했습니다. 특히, immunotherapy 금지 검사점의 억제에 따라 PD 1 좋아하고 CTLA-4은 임상적으로 효과적인1,2,3,,45, 것으로 보고 되었습니다. 6. 단일 클론 항 체 CTLA-4에 대 한 PD-1, 또는 프로그램 죽음 Ligand 1 (PD-L1) 이미 여러 암에 승인 되 고 오래 견 딘 임상 응답 환자7의 20% 이상으로 이어질. 그럼에도 불구 하 고, 모든 환자는 초 동 조치, 치료의 비용은 높다, 되며 이러한 치료 독성, 잠재적인 심각한 면역 같은 부작용을 선도. 따라서, 현재 도전 예측 마커 그 새로운 immunotherapies 식별 것입니다. 종양, PD-L1, 표현 또는+ T 세포 침투 intratumoral CD8의 수준에서 돌연변이의 속도와 임상 응답 상관 관계를 보고 되었습니다. 그러나,이 협회는 아직도 너무 약 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 환자8 에서에서 Pembrolizumab의 관리 전에 PD L1 동반자 테스트 제외 임상 연습에서 이러한 임상 생체의 사용을 권장 해 ,91011,12. 그것은 많은 금지 수용 체의 공동 식 같은 PD-1, 팀 3, 지연-3, 고 CTLA-4 유도 세포 소모 형 그리고 치료13,,1415저항 증명 되었습니다. 말 초 혈액 종양 microenvironment의 대표 이므로, 셀 제자리의 phenotypic 특징을 분석 하 고 관심입니다. PD-1 팀-3 공동 표현 T 세포 기능 장애가 여러 컨텍스트13,,1617셀 수 알려져 있습니다. 이 연구에서 두 금지 수용 체 PD 1의 공동 식과 CD8-3 팀의 전조 영향+ T 세포를 평가 했다.
종양 침투 림프 톨 (TILs)에 여러 마커의 공동 식 공부는 지금까지 최대 주로 신선한 종양 및 따라서 제외 회고전 분석에 작동 하는 데 필요한 만드는 흐름 cytometry 분석에 의해 수행 되었습니다. 기존의 현장에 얼룩, 한 번에 하나의 얼룩 수행할 수 있습니다와 공동 마커를 표현 하는 셀 형식의 특성은 불가능 하다. 예를 들어 PD L1 기존의 immunohistochemistry 분석 표현 PD L1 셀은 더 많은 상호 연구 관련 하 여 정의 하 고 어려운 종양 microenvironment의 많은 세포 유형으로 표현 됩니다. 이 작품에서는, 우리는 혁신적인 위치에 multiparametric 면역 형광 검사 방법을 개발 CD8 침투 종양에 의해 PD-1 팀-3의 공동 식 연결할 컴퓨터 계산+ T-세포 RCC에서 임상 결과. 이 기술은 여러 이점이 있다, 단일 셀 수준 및 여러 표식에 제한 된 간격을 캡처할 수 있는 multispectral 카메라를 사용 하 여 동시에 분석 하는 가능성을 포함 하 여 > 10 nm 액정을 통해 필터18. 또한, 절차는 자동 간 연산자 재현성 및 수동 기법19에 비해 단축된 분석 수 있습니다. 암 분야에서 여러 연구 보고에 메르켈 세포 암, 폐 암, 머리와 목 암20,,2122, 같은 PD-1, PD-L1, 및 CD8 면역 분자의 여러 stainings를 설득 23. 자동된 세포 수는 사용자 (형질 단계) 교육 가능 하다. 형광은 다른 세포 격실 (핵, 세포질, 막)에서 측정 됩니다.
여기, CD8 종양 침투의 다른 하위 집합+ T 세포 표현 PD-1 및 RCC의 대형 코 호트에서 팀-3 계산 했다 고 결과 임상 중력 점수 및 생존 매개 변수 연관 되었다. 그것은 또한 cytometry에 같은 의미 형광 강도 (MFI) 데이터는 셀룰러 해상도에서 막 형광 강도 분석 가능. 우리가 아는 첫 번째 연구 보고 전조 결과를이 multispectral 영상 기반된 수 기술을 사용 하 여 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수정 및 문제 해결:
조직의 품질은 중요 한 매개 변수; 그것은 쉽게 되며 고 오신 채색에 의해 확인할 수 있습니다.
기술의 장점 중 하나는 다중화 된 stainings의 가능성 하지만 10 nm 최소의 델타 방출 파장을 선택 하는 것 권장 fluorophore 넘침을 방지 하려면. 여기, 우리가 4 stainings DAPI를 포함 하기 때문에, 우리는 하기로 파장 밖으로 확산 (DAPI: 460 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 인 국가 뒤 암 (잉카) (동부 표준시), 리그 죄수 르 암 (동부 표준시), 대학교 소 르 본 파리 시 테 (동부 표준시), ANR (Selectimmunco) (동부 표준시), Labex 면역-종양학 (동부), SIRIC CARPEM (CG, 동부 표준시)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. EdG은 Fondation 아크의 친교에 의해 투자 되었다. EV 및 CD APHP (증권 거래소 검색 대회)의 친교에 의해 투자 되었다. 조흥은 대학교 소 르 본 파리 시 테 (성립 박사)의 친교에 의해 자금이 다. 저자는이 프로젝트에 그들의 자금에 대 한 브리스톨 마이어스 스 퀴 브를 감사 합니다. 저자는 병원 Européen 조르주 퐁피두의 병 리 및 Necker (Laurianne 챔 블, 엘 로디 미셸 Gisèle Legall)의 부를 감사합니다. 저자는 PARCC, 병원 Européen 조르쥬 퐁피두 (코 린 Lesaffre)의 조직학 플랫폼을 감사합니다.
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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