Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica
Summary
Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l’espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.
Abstract
Nei modelli di ricerca di cancro del fegato, di rigenerazione, di infiammazione e di fibrosi, sistemi flessibili per in vivo l’espressione genica e silenziamento sono molto utili. Iniezione della vena della coda idrodinamica dei costrutti basati su trasposone è un metodo efficiente per la manipolazione genetica degli epatociti in topi adulti. Oltre l’espressione costitutiva del transgene, questo sistema può essere utilizzato per applicazioni più avanzate, come implicazione di colpo, di shRNA-mediata del gene del sistema CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni del gene, o sistemi di viscoelastici. Qui, la combinazione dell’espressione costitutiva CreER insieme espressione inducibile di un transgene o miR-shRNA di scelta si presenta come un esempio di questa tecnica. Copriamo la procedura multi-step a partire dalla preparazione della bella addormentata-trasposone costruisce, per l’iniezione e il trattamento dei topi e la preparazione del tessuto del fegato per analisi immunostaining. Il sistema presentato è un approccio affidabile ed efficiente per realizzare complesse manipolazioni genetiche negli epatociti. È particolarmente utile in combinazione con ceppi di topi Cre/loxP-based e può essere applicato ad una varietà di modelli nella ricerca dell’affezione epatica.
Introduction
L’affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo1. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato2. Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l’espressione genica in epatociti sono pertanto utili3. Metodi consolidati come l’allevamento di ceppi di topi geneticamente o la generazione di vettori virali per l’infezione dell’epatocita sono entrambi harbor richiede tempo, problemi di sicurezza, o cedere l’espressione del transgene poveri in epatociti in vivo 4 , 5. iniezione della vena della coda idrodinamica (HTVI) è un metodo alternativo per la transfezione in vivo degli epatociti che consente per l’interrogatorio di facile, veloce e conveniente di funzione del gene nel fegato. Per HTVI, un vettore contenente la sequenza di DNA desiderata è dissolto in un volume di soluzione fisiologica corrispondente al 10% del peso corporeo dell’animale iniettato. La soluzione allora è iniettata nella vena della coda entro 5-10 s6. Superiore a gittata cardiaca, le saline scorre dalla vena cava inferiore nelle vene del fegato, che porta all’espansione del fegato e idrodinamica transfezione di epatociti7. Per realizzare l’integrazione genomica stabile, il metodo è stato combinato con vettori basati su trasposone, quali il sistema di trasposone dormire bellezza. Sistemi di questo media la ricombinazione dei vettori di destinazione con i siti di ricombinazione genomica catalizzate da un sonno bellezza –transposase8,9. Per i modelli di fibrosi del fegato o di carcinogenesi, è spesso desiderabile ai geni iperesprimere o silenzio determinati intervalli di tempo del modello di malattia. Per questo scopo, strumenti per l’espressione genica viscoelastica come Cre/LoxP-sistema o il sistema di espressione del gene tetraciclina-inducibile (Tet-On) può essere usato10.
Qui, descriviamo un protocollo per la transfezione in vivo di epatociti murini utilizzando HTVI di un sistema basato su trasposone addormentata . Oltre a un protocollo per l’espressione stabile, costitutiva di un transgene sotto il controllo di un promotore di fegato-specific, descriviamo un sistema più avanzato di vettore che unisce l’espressione costitutiva di tamoxifen-dipendente Cre ricombinasi (CreER) con la induzione dell’espressione genica di un transgene o shRNA adattato microRNA (miR-shRNA), chiamato il pTC TET-sistema11. In questo sistema vettoriale, transgeni inducibile o miR-shRNA per espressione tetraciclina-dipendente vengono clonati nel vettore backbone con un sistema di clonazione recombinational, permettendo la generazione facile e veloce di nuovi vettori12. Questa guida basate su video descrive la preparazione di opportuni vettori, iniezione e il trattamento dei topi per ottenere l’espressione del transgene/miR-shRNA viscoelastica ed infine la preparazione del tessuto del fegato per l’analisi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato per consentire la combinazione di qualsiasi sistema di topo Cre/loxP mediato con l’espressione o knock-down di qualsiasi gene di scelta, che lo rende un sistema ampiamente applicabile nella ricerca dell’affezione epatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfezione di epatociti con l’iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un metodo stabilito sin dalla sua introduzione più di 15 anni fa6. Il volume iniettato supera la gittata cardiaca e confluisce dalla vena cava inferiore i sinusoids del fegato7, che conduce alla trasfezione di circa 10-20%, in alcuni casi fino al 40% di epatociti25,26. Predittori di una riuscita transfezione sono il volume ini…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Deutsche Krebshilfe, Germania (codice di autorizzazione 111289 per UE), il Lucile Packard Foundation per salute dei bambini (Ernest e Amelia Gallo dotato Postdoctoral Fellowship – numero di concessione CTSA UL1 RR025744 per UE). Grazie Dr Mark A. Kay per vettore costrutti e consulenza sperimentale e Dr Julien Sage per topi e sperimentali supportano.
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
Referências
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