Summary

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

Published: February 02, 2018
doi:

Summary

Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.

Abstract

En modelos de investigación de cáncer de hígado, inflamación, regeneración y fibrosis, flexible para en vivo gene expresión y silenciamiento son muy útiles. Inyección en la vena hidrodinámica cola de construcciones basadas en el transposón es un método eficiente para la manipulación genética de hepatocitos en ratones adultos. Además la expresión del transgen constitutiva, este sistema puede utilizarse para aplicaciones más avanzadas, como consecuencia de precipitación, shRNA-mediado del gene del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones genéticas, o sistemas inducibles. Aquí, la combinación de la expresión constitutiva de CreER junto con la expresión inducible de un transgen o miR-shRNA de elección se presenta como un ejemplo de esta técnica. Cubrimos el procedimiento de varios paso a partir de la preparación de la bella durmiente-transposon construye, a la inyección y el tratamiento de ratones y la preparación del tejido hepático para su análisis por immunostaining. El sistema presentado es un acercamiento confiable y eficiente para lograr complejas manipulaciones genéticas en los hepatocitos. Es especialmente útil en combinación con cepas de ratón basados en Cre/loxP y puede aplicarse a una variedad de modelos en la investigación de la enfermedad hepática.

Introduction

Enfermedad del higado crónica presenta una carga de salud importante en todo el mundo1. Modelos de investigación animal son herramientas esenciales en el estudio de la enfermedad hepática y han ayudado a responder preguntas complejas en la regeneración del hígado, inflamación hepática, esteatosis como cáncer de hígado2. Un número considerable de estos modelos animales se basan en la modificación genética de las células del hígado. Por lo tanto, herramientas eficaces para manipular genes en los hepatocitos están útil3. Métodos establecidos, tales como la cría de las cepas de ratón modificados genéticamente o la generación de vectores virales para la infección del hepatocito son o puerto mucho tiempo, preocupaciones de seguridad o rendimiento pobre transgene expresión en hepatocitos en vivo 4 , 5. inyección en la vena hidrodinámica cola (HTVI) es un método alternativo para en vivo de la transfección de hepatocitos permitiendo interrogatorio fácil, rápido y eficiente de la función génica en el hígado. Para HTVI, un vector con la secuencia de ADN deseada se disuelve en un volumen de solución salina correspondiente al 10% del peso corporal del animal inyectado. La solución entonces se inyecta en la vena de la cola dentro de 5-10 s6. Exceder el gasto cardiaco, la solución salina fluye de la vena cava inferior en las venas hepáticas, hacia la expansión del hígado y la hidrodinámica de la transfección de hepatocitos7. Para lograr la integración genómica estable, el método se ha combinado con vectores transposon-basados, tales como el sistema de transposon dormir belleza. Este sistema interviene en la recombinación de vectores objetivo con los sitios de recombinación genómica catalizados por transposasa dormir belleza-8,9. Para los modelos de fibrosis hepática o carcinogénesis, a menudo es deseable que sobrexpresan o silencio genes en ciertos momentos del modelo de la enfermedad. Para ello, herramientas para la expresión de genes inducibles como el sistema Cre/LoxP o el sistema de expresión del gen inducible por tetraciclina (Tet-) pueden ser usados10.

Aquí, describimos un protocolo de la transfección en vivo de hepatocitos murinos utilizando HTVI de un durmiente transposon-sistema. Además de un protocolo de expresión constitutiva, estable de un transgen bajo el control de un promotor específico de hígado, describimos un sistema de vectores más avanzado que combina la expresión constitutiva de recombinase (CreER) de Cre de tamoxifeno-dependiente con la expresión inducible de un transgén o shRNA adaptado de microARN (miR-shRNA), llamado el pTC TET-system11. En este sistema de vectores, los transgenes inducibles o miR-shRNAs de expresión dependiente de la tetraciclina son clonados en el vector de la columna vertebral con un sistema de clonación recombinational, permitiendo la fácil y rápida generación de nuevos vectores12. Esta guía de video abarca la preparación de vectores adecuados, inyección y tratamiento de los ratones para lograr la expresión del transgen/miR-shRNA inducible y finalmente la preparación de tejido hepático para su análisis. El método descrito en este protocolo fue diseñado para permitir la combinación de cualquier sistema Cre/loxP mediada del ratón con la expresión o la precipitación de cualquier gen de elección, lo que es un sistema ampliamente aplicable en la investigación de la enfermedad hepática.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por las autoridades responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania y Stanford institucional Animal cuidado y Use Comité, Stanford, CA, USA). Se proporciona una lista de todos los plásmidos para la clonación (paso 1 a 4) en la tabla suplementaria S1. 1. clonación de un transgen para la expresión del gen constitutivo Diseño de cebadores…

Representative Results

Eficacia de transfección por inyección en la vena hidrodinámica cola: El porcentaje de hepatocitos murinos que son transfectadas hidrodinámico de una sola inyección es variable y depende de varios parámetros tales como volumen de inyección, tiempo de inyección, cantidad de ADN inyectado y el tamaño de la construcción inyectado6, 22,23. Además, la eficiencia de transfe…

Discussion

Transfección de hepatocitos con inyección en la vena hidrodinámica cola se ha convertido en un método establecido desde su introducción hace más de 15 años6. El volumen inyectado excede gasto cardiaco y fluye de la vena cava inferior en los sinusoides del hígado7, llevando a la transfección de unos 10-20%, en algunos casos hasta el 40% de hepatocitos25,26. Predictores de una exitosa transfección son el vol…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Deutsche Krebshilfe, Alemania (número de licencia 111289 a UE), la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños (Ernest y Amelia Gallo dotado Beca Postdoctoral – número de la concesión de la CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos a Dr. Mark A. Kay vector construcciones y asesoramiento experimental y Dr. Julien Sage para los ratones experimentales y apoyan.

Materials

General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

Referências

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check_url/pt/56613?article_type=t

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Citar este artigo
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).

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