JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Genética

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

Published: February 02, 2018
doi:
10.3791/56613
, , , , ,
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar,Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine,Medical Center University of Freiburg

Summary

Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baseret integration vektorer giver stabil Transfektion af murine hepatocytter in vivo. Vi præsenterer her, en praktisk protokol til Transfektion systemer, der giver mulighed for den langsigtede konstitutiv udtryk for en enkelt transgen eller kombinerede konstitutiv og doxycyclin-inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA i leveren.

Abstract

I forskning modeller af leverkræft, regenerering, inflammation og fibrose er fleksible systemer for i vivo genekspression og silencing meget nyttig. Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baserede konstruktioner er en effektiv metode til genetisk manipulation af hepatocytter i voksen mus. Ud over konstitutiv transgen udtryk, kan dette system bruges til mere avancerede applikationer, såsom shRNA-medieret gen knock-down, konsekvenser af CRISPR/Cas9-systemet til at fremkalde genmutationer eller inducerbar systemer. Her, er kombinationen af konstituerende CreER udtryk sammen med inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA valg præsenteret som et eksempel på denne teknik. Vi dækker Multi-trins procedure fra udarbejdelsen af Tornerose-transposon konstruktioner, injektion eller behandling af mus, og forberedelse af levervævet til analyse af immunfarvning. Systemet præsenteret er en pålidelig og effektiv tilgang til at opnå komplekse genetiske manipulationer i hepatocytter. Det er specielt nyttig i kombination med Cre/loxP-baserede mus stammer og kan anvendes til en bred vifte af modeller i forskning af leversygdom.

Introduction

Kronisk leversygdom præsenterer en større sundhed byrde på verdensplan1. Dyreforskning modeller er uundværlige redskaber i studiet af leversygdom og har hjulpet med at besvare komplekse spørgsmål i leveren regenerering, hepatisk betændelse, og steatose samt leverkræft2. Et betydeligt antal af disse dyremodeller er afhængige af den genetiske modifikation af leverceller. Derfor, effektive værktøjer til at manipulere genekspression i hepatocytter er nyttigt3. Etablerede metoder såsom opdræt af gensplejsede mus stammer eller generation af virale vektorer for hepatocyt infektion er enten tidskrævende, harbor sikkerhedsproblemer, eller give fattige transgen udtryk i hepatocytter i vivo 4 , 5. hydrodynamiske hale vene injektion (HTVI) er en alternativ metode til i vivo Transfektion af hepatocytter giver mulighed for nem, hurtig og omkostningseffektiv forhør af genet fungerer i leveren. For HTVI opløses en vektor, bærer det ønskede DNA-sekvens i en mængde af saltvand svarende til 10% af kropsvægten af det injicerede dyr. Løsningen er derefter sprøjtet ind i halen vene inden for 5-10 s6. Overstiger minutvolumen, løber saltvand fra den ringere vena cava i leveren venerne, fører til udvidelse af leveren og Hydrodynamisk Transfektion af hepatocytter7. For at opnå stabil genomisk integration, har metoden været kombineret med transposon-baserede vektorer, som den sovende skønhed –transposon system. Denne systemer medierer rekombination af target vektorer med genomisk rekombination websteder katalyseret af en sovende skønhed –transposase8,9. Modeller af leverfibrose eller carcinogenese er det ofte ønskeligt at overexpress eller stilhed gener på visse tidspunkter af sygdom model. Til dette formål, værktøjer til inducerbar genekspression som Cre/LoxP-system eller tetracyklin-inducerbar gen expression system (Tet-On) kan være brugt10.

Her, beskriver vi en protokol for i vivo Transfektion af murine hepatocytter ved hjælp af HTVI af en sovende skønhed transposon-baseret system. Ud over en protokol for stabil, konstituerende udtryk for en transgen under kontrol af en lever-specifikke promotor, vi beskriver en mere avanceret vektorsystem, der kombinerer konstitutiv tamoxifen-afhængige Cre recombinase (CreER) udtryk med den inducerbar udtryk for en transgen eller mikroRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kaldet pTC TET-systemet11. I denne vektorsystem er inducerbar transgener eller miR-shRNAs for tetracyclin-afhængige udtryk klonet i rygraden vektor med en recombinational kloning ordning, tillade den hurtige og nem generation af nye vektorer12. Denne video-baserede vejledning omfatter udarbejdelsen af passende vektorer, injektion og behandling af musene at opnå inducerbar transgen/miR-shRNA udtryk, og endelig forberedelse af levervævet til analyse. De i denne protokol beskrevne metode var designet til at aktiverer kombinationen af enhver Cre/loxP medieret mus system med udtrykket eller knock-down af enhver gene af valg, hvilket gør det til et almindeligt gældende system i forskning af leversygdom.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført efter retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af myndighederne (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institutionelle dyrs pleje og bruge udvalget, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trin 1-4) er fastsat i supplerende tabel S1. 1. kloning af et transgen til konstituerende genekspression Design primere for transgen forstærkning13,…

Representative Results

Transfektion effekten af hydrodynamiske hale vene injektion: Procentdelen af murine hepatocytter, der er transfekteret hydrodynamically af en enkelt injektion er variabel og afhænger af flere parametre såsom Injektionsvolumen, injektion tid, mængde injiceret DNA, og størrelsen af den injicerede konstruere6, 22,23. Derudover er Transfektion effektivitet generelt lavere i stø…

Discussion

Transfektion af hepatocytter med Hydrodynamisk hale vene injektion er blevet en etableret metode siden introduktionen mere end 15 år siden6. Den injicerede volumen overstiger minutvolumen og løber fra den ringere vena cava i sinusoids af leveren7, fører til Transfektion af ca 10-20%, i nogle tilfælde op til 40% af hepatocytter25,26. Prædiktorer for en vellykket Transfektion er den injicerede volumen pr. injicer…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Krebshilfe, Tyskland (tilskud antal 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for børns sundhed (Ernest og Amelia Gallo begavet postdoc stipendium – CTSA tilskud antal UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruktioner og eksperimenterende rådgivning og Dr Julien Sage til mus og eksperimentel støtte.

Materials

General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

In VivoGenetic ModificationMouse HepatocytesHydrodynamic Tail Vein InjectionConstitutive SystemInducible SystemCreERShRNAVector ConstructLiver ResearchLiver CancerLiver Regeneration
check_url/pt/56613?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image