Сайт направлен иммобилизации костных морфогенетических белка 2 для твердых поверхностей по химии нажмите
Summary
Биоматериалов, легированного костных морфогенетических белков 2 (БМП2) использовали как новые терапевтические стратегии для лечения переломов костей не входящих в союз. Для преодоления побочных эффектов в результате неконтролируемого высвобождения фактора, мы предлагаем новую стратегию на сайт-непосредственно иммобилизации фактор, создавая тем самым с расширенными возможностями Остеогенные материалы.
Abstract
Интенсивно исследуются различные терапевтические стратегии для лечения незаживающих дефектов длинной кости. В настоящее время используется настоящее лечение несколько ограничений, которые привели к использованию биоматериалов в сочетании с Остеогенные факторы роста, такие как костных морфогенетических белков (БМП). Часто используемые методы поглощения или инкапсуляция требуют выше физиологические количество БМП2, что обычно приводит к эффект релиз так называемый первоначальный всплеск, который провоцирует несколько тяжелых побочных эффектов. Возможная стратегия преодоления этих проблем бы ковалентно пара белка на эшафот. Кроме того муфты должны выполняться на основе конкретных для того чтобы гарантировать воспроизводимость продукции результат. Таким образом мы создали БМП2 вариант, в котором искусственного аминокислота (Пропаргиловый L-лизин) было введено в зрелой части белка БМП2 кодон использования расширения (БМП2-K3Plk). БМП2-K3Plk был соединен функционализированных бусины через медные катализируемой азид алкины циклоприсоединения (CuAAC). Биологическая активность спаренных БМП2-K3Plk была доказана в пробирке и Остеогенные активности БМП2-K3Plk-функционализированных бусины было доказано в ячейке на основе анализов. Функционализированных бусы при контакте с C2C12 клетки смогли побудить щелочной фосфатазы (ALP) выражение в локально ограниченных близости из бисера. Таким образом, в этой технике, может производиться функционализированных подмостей, может вызвать дифференцировки клеток к Остеогенные линии. Кроме того более низкие дозы БМП2 достаточно за счет контролируемой ориентации сайта направленных спаренных БМП2. С помощью этого метода БМП, всегда подвергаются их рецепторами на поверхности клеток в соответствующей ориентации, которая не в случае, если факторы соединены через сайт направлен муфты методов. Итоги продукт очень управляемым, и, таким образом, результаты в материалах с однородными свойствами, улучшение их применимость для ремонта критического размера костных дефектов.
Introduction
Конечная цель костной ткани инженерии и костной регенерации является преодолеть недостатки и ограничения, возникающие во время общего лечения переломов не входящих в союз. Авто – или Алло трансплантация преимущественно используются в качестве текущей стратегии терапии, хотя они оба имеют несколько недостатков. Идеальный костного трансплантата должно побудить Остеогенез osteoinduction, а также osteoconduction, ведущих к остеоинтеграции имплантата в кость. В настоящее время только Авто трансплантации рассматривается как «золотой стандарт», так как она обеспечивает все характеристики идеального костного трансплантата. К сожалению он также представляет важные негативные аспекты, такие как длинные операции раз и второй сайт травмы, что обычно влечет за собой больше осложнений (например, хронической боли, гематома образований, инфекции, косметических дефектов и т.д.). Аллогенной графтов, с другой стороны имеют субоптимальные характеристики для всех общие аспекты1. Альтернативные костного трансплантата технологии улучшились за последние несколько лет, с тем чтобы производить строительные леса, которые являются osteoinductive, остеокондуктивных, биологически и салфетка. Поскольку многие биоматериалов не показывают все эти Остеогенные характеристики, различные факторы роста, главным образом БМП2 и BMP7, были включены с целью улучшения Остеогенные потенциал конкретного леса2.
Как важным критерием такие системы доставки фактор роста должны обеспечивать контролируемые дозы выпуска со временем облегчить основные события, как набор ячеек и привязанности, врастание клеток и ангиогенеза. Однако БМП также, как другие Остеогенные факторы роста были обычно прикол non-covalently3. Провокация и адсорбции методы требуют использования выше физиологические количество белка из-за первоначальный всплеск-релиз, который приводит к серьезные недостатки в естественных условиях, обычно влияющих на окружающих тканей, вызывая разрастание костной ткани, 4остеолиза, отек и воспаление. Таким образом сохранение факторов роста на сайте доставки для более длительных периодов времени может быть достиган ковалентной иммобилизации методами. Химически изменены БМП2 (succinylated5, ацетилированный6 или7биотинилированным), инженерии гетеродимерами8или БМП2 производных Олигопептиды9 были разработаны и использованы для преодоления ограничений, связанных с поглощение. Однако био деятельность этих конструкций не является предсказуемым, поскольку соглашение потенциально препятствует привязки иммобилизованных лигандом клеточных рецепторов. Как показано ранее важно, что все четыре цепи рецептора участвует в формировании активированного лиганд рецептор комплексов взаимодействуют с иммобилизованными БМП2 для того, чтобы полностью активировать все ниже по течению сигнальные каскады10.
Для преодоления проблем исход неоднородных продукт с ограничениями с точки зрения биологическую, стабильность и биодоступность подвижности фактора, мы разработали BMP вариант, способный ковалентно привязки подмостей образом ориентированные на сайт. Этот вариант, называется БМП2-K3Plk, состоит из искусственного аминокислоты, который был представлен генетические кодон расширения11. Этот вариант был успешно связаны с подмостей, используя стратегию ковалентная связь при сохранении своей биологической активности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генерации протеин тегами вариантов расширения генетических кодон позволяет введение различных ненатуральных аминокислоты аналогов главным образом в любом месте основного белка последовательности. В случае БМП как БМП2, общей теги, такие как тег 6-гистидин (его) может быть только предс…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р M. Рубини (Констанц, Германия) для обеспечения кодирования pyrrolysyl-tRNA плазмида и предоставление pRSFduet-pyrtRNAsynth кодирования соответствующей аминоацил тРНК-синтетазы.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
Referências
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
