A ingestão de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar as capacidades de absorção de fluido em insetos
Summary
Alimentação de fluido insetos têm a capacidade de adquirir quantidades de líquidos de superfícies porosas. Este protocolo descreve um método para determinar diretamente a capacidade para insetos de ingerir líquidos de superfícies porosas, usando soluções de alimentação com nanopartículas fluorescentes, magnéticas.
Abstract
Alimentação de fluido insetos ingerem uma variedade de líquidos que estão presentes no ambiente, como piscinas, filmes, ou confinado em pequenos poros. Estudos de aquisição líquida exigem avaliar relações de estrutura e função de mouthpart; no entanto, os mecanismos de absorção de fluido são inferidos historicamente observações da arquitetura estrutural, às vezes acompanhada com evidências experimentais. Aqui, nós relatamos um novo método para avaliar as capacidades de absorção de fluido com borboletas (Lepidoptera) e moscas (Diptera) usando pequenas quantidades de líquidos. Insetos são alimentados com uma solução de sacarose 20% misturada com nanopartículas fluorescentes, magnéticas, de papéis de filtro de tamanhos de poros específicos. A colheita (estrutura interna usada para armazenar líquidos) é removida do inseto e colocada em um microscópio confocal. Um ímã é acenou pela cultura para determinar a presença de nanopartículas, que indicam se os insetos são capazes de ingerir líquidos. Esta metodologia é utilizada para revelar um mecanismo de alimentação generalizado (ação capilar e formação de ponte líquida) que é potencialmente compartilhado entre Lepidoptera e Diptera ao se alimentar de superfícies porosas. Além disso, este método pode ser usado para estudos de mecanismos entre uma variedade de alimentação de fluido de insetos, incluindo os importantes na transmissão da doença e biomimética e potencialmente outros estudos que envolvem condutas de micro ou nano porte de alimentação onde transporte líquido requer verificação.
Introduction
Muitos grupos de insetos possuem peças bucais (proboscises) adaptado para alimentando-se de líquidos, como néctar, fruta, a apodrecer do sap fluxos (por exemplo, Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xilema (Hemiptera4), lágrimas (Lepidoptera 5) e sangue (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera,9). A capacidade de insetos que se alimentam de fluidos é relevante para a saúde do ecossistema (ex . polinização10), doença transmissão4,11, biodiversification2,12e estudos de evolução convergente,13. Apesar da grande variedade de fontes de alimento, um tema entre alguns insetos de alimentação de fluido é a capacidade de adquirir pequenas quantidades de fluidos, o que poderiam ser confinados a gotículas de micro ou nano-porte, filmes líquidos ou superfícies porosas.
Dada a extensa diversidade de insetos de alimentação de fluido (mais de 20% de todas as espécies animais14,15) e sua capacidade de se alimentar de uma variedade de fontes de alimentos, compreendendo sua alimentação comportamentos e mecanismos de absorção de líquido é importante em muitos campos. Funcionalidade de insetos mouthpart, por exemplo, tem desempenhado um papel no desenvolvimento da tecnologia biomimetic, por exemplo, dispositivos microfluídicos que podem executar tarefas tais como a aquisição de pequenas quantidades de líquidos usando métodos semelhantes aos utilizados por insetos16. Um problema fundamental nos estudos dos mecanismos de absorção de fluidos, no entanto, é determinar não só como os insetos se alimentam de fluidos, mas evidências experimentais que suporta o mecanismo de aquisição. Usando apenas o comportamento (por exemplo, sondando com o narigudo12,17) como um indicador para a alimentação é insuficiente, porque isso não confirma a captação bem sucedida de fluidos, nem fornecer um meio para determinar a rota que fluidos de viagem como passam através do inseto. Além disso, realizando experiências com pequenas quantidades de líquidos melhores representa cenários alimentação naturais, onde os fluidos são uma limitação recurso2,12.
Raio-x da fase utilizou-se imagens de contraste da borboleta monarca (Danaus plexippus L.), para avaliar como as borboletas se alimentam de pequenas quantidades de líquidos de superfícies porosas12. Borboletas-monarca use ação capilar através de espaços entre as projeções de cuticular (dorsal legulae) junto a tromba para trazer fluidos confinados a pequenos poros no canal alimentar. Os fluidos de entrada formam um filme sobre a parede do canal alimentar que cresce e entra em colapso em uma ponte de líquido pelo planalto instabilidade12,18, que é então transportado para intestino a borboleta pela ação da bomba de sucção na cabeça. Embora a imagem de contraste de fase raio x é uma ferramenta ideal para a visualização fluxo do fluido dentro insetos12,19,20,21, a técnica não é prontamente disponível e um mais conveniente método é necessário para uma rápida avaliação de habilidade de um inseto de fluidos de captação e ingeri-los.
Para determinar se o mecanismo de alimentação para d. plexippus aplica-se para outros lepidópteros e também para moscas (Diptera) (ambos os grupos que se alimentam de líquidos de superfícies porosas), Lehnert et al 13 aplicou uma técnica para avaliar a habilidade de um inseto para se alimentar de pequenas quantidades de líquidos de superfícies porosas, que é relatada em detalhes aqui. Embora o protocolo descrito aqui é para estudos que usam humedecidos e superfícies porosas, a metodologia pode ser alterada por outros estudos, tais como aqueles abordando mecanismos de alimentação de piscina. Além disso, as aplicações se estende a outros campos, incluindo tecnologia microfluídica e Bioinspirada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funcionalidade de insetos mouthpart historicamente inferida a partir de estudos de morfologia bruta (EG., funcionalidade de lepidópteros narigudo relacionadas com uma bebida de palha25,26); no entanto, estudos recentes que incorporam a evidência experimental resultaram em uma mudança de paradigma em nossa compreensão das complexidades do insetos bucais e13 12,2,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF) conceder n. IOS 1354956. Agradecemos o Dr. Andrew D. Warren (McGuire centro de biodiversidade, Florida Museu de História Natural, Universidade da Flórida e Lepidoptera) permissão usar as imagens de borboleta.
Materials
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
Referências
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