La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos
Summary
Líquido de alimentación insectos tienen la capacidad de adquirir cantidades diminutas de líquido de superficies porosas. Este protocolo describe un método para determinar directamente la capacidad de los insectos a ingerir líquidos de superficies porosas utilizando soluciones de alimentación con nanopartículas magnéticas, fluorescentes.
Abstract
Líquido de alimentación insectos ingieren una gran variedad de líquidos, que están presentes en el ambiente como piscinas, películas, o confinados a pequeños poros. Estudios de adquisición líquido requieren evaluar las relaciones estructura y función del mouthpart; sin embargo, mecanismos de absorción de líquido históricamente se infieren de las observaciones de la arquitectura estructural, a veces acompañado con evidencia experimental. Aquí, Divulgamos un nuevo método para evaluar la capacidad de absorción de líquido con mariposas (Lepidoptera) y moscas (Diptera) con pequeñas cantidades de líquidos. Insectos se alimentan con una solución de sacarosa 20% mezclada con nanopartículas magnéticas, fluorescentes de papeles de filtro de tamaño de poro determinado. El cultivo (estructura interna para guardar líquidos) se extrae del insecto y colocado en un microscopio confocal. Un imán es agitado por el cultivo para determinar la presencia de nanopartículas, que indican si los insectos son capaces de ingerir líquidos. Esta metodología se utiliza para revelar un mecanismo alimentación generalizado (acción capilar y formación de puente líquido) que es potencialmente compartido entre Lepidoptera y Diptera cuando alimentación de superficies porosas. Además, este método puede utilizarse para estudios de mecanismos de entre una variedad de insectos de alimentación de líquido, los importantes incluidos en la transmisión de la enfermedad y biomimética y potencialmente otros estudios que implican tamaño nano o micro conductos de alimentación donde transporte líquido requiere verificación.
Introduction
Muchos grupos de insectos tienen piezas bucales (probóscide) adaptado para alimentarse de líquidos, tales como néctar, frutas, la descomposición de sap flujos (por ejemplo 1de Diptera, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xilema (Hemiptera4), lágrimas (Lepidoptera 5) y sangre (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7,8de Hemiptera, Lepidoptera9). La capacidad de los insectos se alimentan de fluidos es relevante para la salud del ecosistema (por ejemplo, polinización,10), enfermedad transmisión4,11, biodiversification2,12y estudios de evolución convergente13. A pesar de la amplia variedad de fuentes de alimentos, un tema entre algunos insectos de alimentación de fluido es la capacidad de adquirir pequeñas cantidades de líquidos, que podrían limitarse a gotitas de tamaño micro o nano, películas líquidas o superficies porosas.
Dada la amplia diversidad de insectos de alimentación de líquido (más del 20% de las especies animales14,15) y su capacidad para alimentarse de una variedad de fuentes de alimentos, entendiendo su alimentación comportamientos y mecanismos de absorción de líquido es importante en muchos campos. Funcionalidad del mouthpart insectos, por ejemplo, ha desempeñado un papel en el desarrollo de tecnología biomimética, p. ej., dispositivos de microfluidos que pueden realizar tareas como la adquisición de pequeñas cantidades de líquidos utilizando métodos similares a los empleados por insectos16. Un problema fundamental en los estudios de los mecanismos de absorción de líquido, sin embargo, es determinar no sólo cómo insectos se alimentan de líquidos, pero adquirir evidencia experimental que apoya el mecanismo. Únicamente mediante el comportamiento (por ejemplo, sondeando con la probóscide12,17) como un indicador de alimentación es insuficiente porque no confirma la exitosa absorción de líquidos, ni provee un medio para determinar la ruta que fluidos de viaje su paso a través de los insectos. Además, realizar experimentos con pequeñas cantidades de líquidos mejor representa escenarios naturales de alimentación donde los fluidos son un recurso limitante2,12.
Fase de proyección de imagen de contraste se utilizó con la mariposa monarca (Danaus plexippus L.) para evaluar cómo las mariposas se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas12de rayos x. Mariposas monarca usa acción capilar a través de espacios entre proyecciones cuticulares (legulae dorsal) a lo largo de la probóscide para hacer fluidos confinados a pequeños poros en el canal de alimentación. Los fluidos entrantes forman una película en la pared del canal de alimentos que crece y se derrumba en un puente líquido por meseta inestabilidad12,18, que luego es transportada al intestino de la mariposa por la acción de la bomba de succión en la cabeza. Aunque la proyección de imagen contraste fase de rayos x es una herramienta óptima para la visualización de flujo de fluidos en insectos12,19,20,21, la técnica no es fácilmente disponible y más conveniente el método es necesario para la evaluación rápida de la capacidad de un insecto para líquidos de absorción e ingerirlos.
Para determinar si el mecanismo de alimentación de D. plexippus se aplica a otros lepidópteros y también a las moscas (Diptera) (ambos grupos se alimentan de líquidos de superficies porosas), Lehnert et al. 13 aplica una técnica para evaluar la capacidad de un insecto que se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas, que se divulga en detalle aquí. Aunque el protocolo descrito aquí es para estudios que utilizan húmedos y superficies porosas, la metodología puede modificarse para otros estudios, tales como abordar mecanismos de alimentación de piscina. Además, las aplicaciones se extienden a otros campos, incluyendo la tecnología microfluídica y Bioinspirados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funcionalidad de insectos mouthpart históricamente se infiere de los estudios de morfología gruesa (e.g., funcionalidad de lepidópteros probóscide relacionadas con un consumo de paja de25,26); sin embargo, estudios recientes que incorporan evidencias experimentales han dado como resultado un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la complejidad de partes bucales de insectos y las relaciones de estructura y función2<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por National Science Foundation (NSF) subsidio no. IOS 1354956. Agradecemos al Dr. Andrew D. Warren (centro de McGuire para lepidópteros y biodiversidad, Florida Museo de Historia Natural, Universidad de Florida) permiso utilizar las imágenes de la mariposa.
Materials
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
Referências
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F., Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. . Insects and flowers: the biology of a partnership. , (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. . Evolution of the insects. , (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. . Insect biodiversity: science and society. , (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -. K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -. K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -. H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -. C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
