אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול
Summary
נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.
Abstract
פרוטוקול זה מדגים את היכולת של אלקטרון נמוך-שדה פאראמגנטיים תהודה (EPR)-המבוסס על טכניקות בשילוב עם הבדיקות פאראמגנטיים תפקודית כדי לספק מידע כמותי על microenvironment הגידול כימי (טיים), לרבות p O2, pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של פוספט אורגניים interstitial (Pi), ו גלוטתיון תאיים (GSH). בפרט, יישום של בדיקה שפותחו לאחרונה trityl רב תכליתיים מסיסים מספק הזדמנות מתחרות על ויוו מדידות בו-זמניות של pH, pO2 ו- P. אני ב- E xtracellular החלל (תקווה העצמית). המידות של שלושה פרמטרים באמצעות בדיקה אחת מאפשרים את בדיקותיהם המתאם עצמאית של בדיקה הפצה, זמן של המדידות.
Introduction
תפקיד מרכזי של טיים התקדמות סרטן, טיפול הוא מוערך יותר ויותר1. בין פרמטרים פיזיולוגיים חשובים של טיים גידולים מוצקים, רקמות היפוקסיה2, חמצת3,4, גבוהה תוך צמצום קיבולת5, ריכוזים גבוהים של6,תאיים GSH7, פאי interstitial8 מתועדים היטב. הערכות2, pH, Pi, GSH, חמצון-חיזור לא פולשנית ויוו pO מספקים תובנות ייחודיות לתוך התהליכים הביולוגיים טיים, לעזור כלים מראש להקרנה קליניים של תרופות נוגדות סרטן, אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות טיים. גלי רדיו סביר חדירה לעומק ברקמות על ידי תהודה מגנטית (MRI), טכניקות מבוססות EPR שדה נמוך גורם להם את הגישות המתאים ביותר עבור הערכה לא פולשנית של פרמטרים אלה טיים. MRI מסתמכת במידה רבה על הדמיה פרוטונים במים, נעשה שימוש נרחב הגדרות קליניים כדי לספק רזולוציה אנטומי אבל חסר פתרון פונקציונלי. המידות תהודה מגנטית גרעינית זרחן-31 (31P-NMR) של חוץ-תאית Pi ריכוז ו- pH בהתבסס על אות מ פוספט אנדוגני פוטנציאלי אטרקטיבי עבור אפיון טיים, אבל הם בדרך כלל על ידי רעולי פנים מספר פעמים גבוה יותר תאיים Pi ריכוזים9,10. לעומת זאת, מדידות EPR לסמוך על ספקטרוסקופיה, הדמיה של מיוחד המיועד הגששים פאראמגנטיים לספק פתרון פונקציונלי. שים לב כי הגששים EPR אקסוגני יש יתרון על פני אקסוגני NMR רגשים בשל הרגישות גבוהה יותר של מהותי של EPR ואת היעדר רקע אנדוגני EPR אותות. ההתפתחות האחרונה של nitroxyl pH, חמצון-חיזור בתפקוד כפול בדיקה11 ו trityl רב תכליתיים בדיקה12 מספקת הזדמנויות ללא תחרות עבור ויוו מדידות במקביל של מספר פרמטרים טיים שלהם המתאם ניתוחים עצמאיים על בדיקה הפצה והזמן המדידה. הידע שלנו, הם לא שיטות אחרות הזמינות להעריך במקביל ויוו פיזיולוגית כימי טיים פרמטרים חשובים בנושאים החיים, כגון pO2, ה-pHאלקטרוני, Pi, חמצון-חיזור, GSH.
רגשים עבור אין ויוו המידות פונקציונלי:
איור 1 מציג את מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים המשמשים לגישה טיים פרמטרים, אשר כוללים חלקיקים ולא מסיסים הגששים. רגישות גבוהה פונקציונלי, יציבות רקמה חיה, רעילות מינימלית הם כמה מהיתרונות שגורמים חלקיקי הגששים מועדפת על פני מסיסים זונדי ויוו EPR oximetry. לדוגמה, הגששים חלקיקי הגבירו שמירה פעמים באתר של רקמה השתל לעומת הגששים מסיסים המאפשרות מדידת האורך של רקמות pO2 במשך מספר שבועות. מצד שני, הגששים מסיסים להכות חלקיקים הגששים על-ידי מתן מידות המרחבי לפתור באמצעות מבוסס-EPR הדמיה טכניקות כמו גם מאפשר ניתוח בו-זמני של פונקציות מרובות (pO2, pH, Pi, חמצון-חיזור, ו GSH).
איור 1. מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים זה להרכיב טיים הערכת assay. זה כולל את המקדח חלקיקי pO2 , לינק-BuO (R =3CH – O (CH2)3), וזונדים מסיסים: פונקציה כפולה בדיקה pH, חמצון-חיזור, נ; GSH-רגיש הגישוש, RSSR; רב תכליתיים pO2, pH ו- Pi המכשיר microenvironment חוץ-תאית, החללית תקווה. הסינתזה של רגשים אלו תואר 11,הפניות שסופקו12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שהוצגו לאפשר לא פולשנית ויוו הערכת פרמטרים קריטיים של טיים כימי, כלומר pO2pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של interstitial Pi ו GSH תאיים. טכניקות תהודה מגנטית, כגון MRI ו- EPR נמוך-השדה, הן שיטות הבחירה לא פולשנית ויוו בניית פרופיל של פרמטרים אלה טיים. MRI מדמיין מבנים אנטומיים אבל ח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן בחלקו על ידי NIH מעניקה CA194013, CA192064 ו- U54GM104942. WVCTSI הוא הודה על סטארט-אפ ועד VVK, AB, ו- TDE. המחברים תודה ד ר מ’ Gencheva ק’ שטיינברגר על הסיוע עם הניסויים המחשה. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.
Materials
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
References
- Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
- Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
- Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
- Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
- Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
- Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
- Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
- Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
- Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
- Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
- Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
- Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
- Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
- Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
- Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
- Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
- Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).
