절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서
Summary
미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.
Abstract
미토 콘 드리 아에는 필수적인 세포 식물, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH), 플 라빈 아데닌 등 감소 화합물의 산화에서 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 가장 주목할 만한 생산에서에서 수많은 대사 경로에 관여 디뉴클레오티드 (FADH2)입니다. 애기 thaliana 게놈의 완전 한 주석으로 가장 널리 사용 되는 식물 모델 시스템, 따라서 필요 기관 (잎, 뿌리, 또는 꽃)의 다양 한에서 미토 콘 드리 아를 정화 도구를 활용 하는 데 필요한 그것을 설립 했다 그 지금 애기 미토 콘 드 리아 생물학을 공부 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다음 일련의 차등 원심 분리 단계 연속 콜 로이드 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 정화 하 고 더는 원유 미토 콘 드리 아 펠 릿 생산 방식의 다양 한을 사용 하 여 조직의 균질 하 여 미토 콘 드리 아 격리 원심 분리입니다. 콜 로이드 밀도 자료 이후 여러 원심 분리 단계에서 제거 됩니다. 100g의 신선한 잎 조직에서 시작, 미토 콘 드리 아의 2-3 mg 얻어질 수 있다 정기적으로. 이 미토 콘 드리이 아 호흡 실험 다양 한 기판 및 억제제를 사용 하 여 결정 수를 100-250 nmol O2 분-1 mg 총 미토 콘 드리 아 단백질-1 (NADH 의존 율)의 전형적인 속도 표시 기판에 산화 되는 대안 및 시 토 크롬 터미널 oxidases의 용량. 이 프로토콜 연속 콜 로이드 밀도 기울기 및 정화 식물 미토 콘 드리 아의 효율적인 호흡 측정을 사용 하 여 애기 thaliana 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 방법을 설명 합니다.
Introduction
식물 미토 콘 드리 아 연구의 역사는 100 년1다시 갑니다. 그대로 미토 콘 드리 아 처음 1950 년대 초에 고립 되었다 차등 원심 분리를 사용 하 여. 1980 년대에 콜 로이드 밀도 기울기의 출현 삼투성 조정 고통 없이 정화를 미토 콘 드리 아 수 있습니다. 그라데이션 순화 된 미토 콘 드리 아 질량 분석의 감도 때문에, 대부분의 목적을 위해 적당 한 동안 심지어 상대적으로 경미한 오염 물질 검출 될 수 있다 하 고 부적절 하 게 미토 콘 드리 아 위치2를 할당 될 수 있습니다. 둘 다 plastidic 제거 무료 흐름 전기 이동 법의 사용과 peroxisome 오염3, 하지만 무료 흐름 전기 이동 법은 고도로 전문화 된 기술 및 연구의 대부분에 대 한 필요 하지 않습니다. 또한, 그 듀얼 또는 단백질의 여러 대상으로 기억 필요 단백질의 위치를 확인할 때 셀에 발생 합니다. 100 개 이상의 듀얼 타겟된 단백질 엽록체/plastids 그리고 미토 콘 드리 아4, 미토 콘 드리 아를 표적으로 하는 단백질의 숫자에 대 한 설명 그리고 peroxisomes5알려져도 있습니다. 또한, 특정 자극, 예를 들면 산화 긴장에서 단백질의 재 위치 세포 생물학6신흥 테마입니다. 따라서, 단백질의 위치, 공부 하는 생물학의 문맥에서 고려 될 필요가 고 다양 한 접근법을 결정 하 고 위치2확인 사용 됩니다.
미토 콘 드리 아는 일반적으로 균질 하 여 식물 조직에서 분리, 균형 열 출시 미토 콘 드리 아, 세포 벽을 깨는 사이 미토 콘 드리 아를 손상 되지 필요 합니다. 전통적으로, 감자와 콜리플라워, 균질 액체 추출 버퍼 활동을 유지 하기 위해 다양 한 구성 요소를 만들기 위해 가정용 믹서 기/과즙 짜는 기구를 사용 됩니다. 완두콩 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 (젊은 묘 (~ 10 일)를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 인기 있는 소재 잎 소재는 부드러운 세포를 lyse를 믹서 기를 이용 한다. 애기 thaliana T-DNA insertional 노크 아웃 라인의 가용성, 미토 콘 드리 아 기능 연구를 수행을 정화 수 필요 잎, 뿌리 또는 꽃에서 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 개발을 필요한가 조직입니다. 전반적으로 다른 식물에 대 한 개발 방법을 잘7, 최적화 하는 데 필요한 재료의 연 삭 임시 수입으로 일했다. 애기가 다양 한 방법 (아래 참조)에 달성 될 수 있다 및 조직 유형 (촬영 대 루트) 사이 다릅니다. 연속 그라디언트를 사용 하 여 또한 다른 장기에서 미토 콘 드리 아의 밀도로 최적화 될 수 있습니다 또는 발달 단계 의미 그들은 다르게 마이그레이션할 수 있습니다. 따라서, 최대 분리에 대 한 그라데이션 밀도 최고의 분리를 달성 하기 위해 정제 된 수 있습니다.
일단 정화는 미토 콘 드리 아 연구, 단백질 및 tRNA 통풍 관 실험, 효소 활동 분석 실험, 호흡 수 측정 서쪽 오 점 분석 등의 다양 한 사용할 수 있습니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 단백질 풍부의 질량 분석 분석에 사용할 수 있습니다. 타겟 단백질, 정의 하지만 중요 한 분석 결과 개발 필요 여러 반응 감시 (MRM) 분석의 정량화에 대 한 수 있습니다. 반면, 디 메 틸 또는 다른 동위 원소 라벨8, 부 량 차이 식별 하는 전체 프로테옴 소설을 생물 학적 통찰력을 발견 하는 데 사용할 수 있습니다 걸쳐 발견 접근법을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로, 애기에서 미토 콘 드리 아의 분리 5 밀리 그램 보다 큰 수익률 자주 철저 한 연 삭으로 얻을 수 있지만 약 80-100 3-4 주 오래 된 식물에서에서 미토 콘 드리 아의 3 mg을 수익률 나뭇잎. 수확량은 성장 조건에 따라 달라진 다 고 미토 콘 드리 아 구조 노화9동안 잘 유지 될 것으로 보인다 비록 senesce, 나뭇잎으로 극적으로 감소. 좋은 수확량을 얻기 위해 가장 중요 한 기능 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 오스트레일리아 연구 위원회 센터의 우수 공장 에너지 생물학 CE140100008는 호주 연구 협의회 미래 친교 (FT130100112) Feodor Lynen 연구 친교 (알렉산더 폰 훔볼트 MWM, 하에 의해 지원 되었다 재단, 독일) js.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Referências
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