Изоляция и выращивания взрослых крыс кардиомиоцитов
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC). Изолированные ARVC может использоваться для краткосрочной и долгосрочной перспективе выращивания. Изоляции и выращивания ARVC могут играть ключевую роль в разработке новых схем лечения сердечных заболеваний.
Abstract
В неповрежденной сердце смежные ячейки влияние взрослых кардиомиоцитов. С метод изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов точное расследование поведения этих клеток под конкретные процедуры и сред возможен. Эта рукопись представляет собой протокол для успешной изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC).
Крыса приносится в жертву шейки матки дислокации глубокой анестезию. Затем сердце извлекается и аорты открыт. Впоследствии перфузии на Langendorff перфузии системы с истощения кальция и коллагеназы лечение проводится. Впоследствии желудочковая ткани получает фарша, повторно распространяется и фильтруют, следуют три центрифугирования шаги с постепенным добавлением CaCl2 до концентрации физиологического кальция. ARVC покрытие на блюдах культуры клеток. После обновления среды культуры клеток, ARVC можно выращивать до шести дней без изменения сыворотки содержащих питательной среды. Изоляция ARVC является сложный процесс кальция. Небольшие изменения внутриклеточной концентрации кальция вызывает снижение качества и жизнеспособность изолированных клеток.
Свеже изолированные ARVC являются стержня в форме. В течение первых дней культивирования они теряют палочковидные морфологии и формы Псевдоподия подобных структур (распространения). При этом морфологическими формирования ARVC первоначально ухудшить их сократительная элементы следуют Реформации через актина стресс волокна и sarcomerogenesis de novo . После одной недели культивирования большинство ARVC показать широкое появление с явно обнаруживаемая крест полосе. Этот процесс является чувствительным к внутриклеточной концентрации кальция, как лечение с ionomycin ослабляет распространения. Ключевые маркеры в этом процессе де и повторно differentiation являются β-миозина тяжелой цепи (β-MHC), oncostatin М (OSM) и swiprosin-1 (EFHD2). Недавние исследования показали, что сердечная ре и де differentiation происходит в условиях культуры имитирует функции видели, в естественных условиях во время Ремоделирование сердца. Таким образом изоляции и выращивания ARVC играют ключевую роль в понимании биологии кардиомиоцитов.
Introduction
Взрослый кардиомиоцитов в естественных условиях работают как электрические синцития, основанный на ячейке контактов между миоцитов. Кроме того они находятся под влиянием соседних ячеек как сердечная фибробластов, эндотелиальных клеток, нейронов и воспалительные клетки1. С целью изучения кардиомиоцитов способность адаптировать их внутриклеточного Организации изменены условия нагрузки, как видно при гипертрофии сердца, что первый шаг приводит к сердечной недостаточности, изоляции и выращивания взрослых желудочков крыса кардиомиоцитов (ARVC) является необходимым2,3,4. Исторически кардиомиоцитов впервые были изолированы от зародышевых куриных сердец5,6. Несколько лет спустя, первый изоляции неизлечимо дифференцированной cardiomyocytes был описан с помощью истощения кальция7. Однако эти взрослые кардиомиоцитов были не кальция терпимая(ый) и поэтому могут не использоваться для функциональных анализов. Наконец в 1976 году новый протокол включен, Пауэлл и твист расследовать взрослых кардиомиоцитов желудочков при физиологических условиях8. В качестве первого шага они изолированы взрослых кардиомиоцитов под низким содержанием кальция концентрации и затем увеличение кальция физиологические концентрации в ступенчатой процедуры. Сегодня большинство протоколов для изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов работать с настоящим Протоколом кальция и использовать коллагеназы для ферментативного пищеварения плотной ячеек контактов1.
Для успешного выращивания требуется плода телячьей сыворотки (FCS) или oncostatin М (OSM). ARVC выполняет де – и повторно – differentiation с обширной структурных изменений, включая Саркомер разборки и Реформации9,10,,1112. Этот процесс сопровождается повторного экспрессии генов плода типа, как тяжелые цепи β-миозина (β-MHC), как известно из гипертрофия и формирование Псевдоподия как структуры, также называемые распространяя4,,11, 13. Кроме того, swiprosin-1 (EFHD2), недавно выявленных белков, играет важную роль в процессе восстановления дифференциация культивируемых ARVC11. В результате ARVC в культуре превратить в широко распространенной, полиморфные клетки, которые спонтанно Показать схватки после двух-трех недель в культуре2,4,14.
Недавние открытия показали, что сердца ре и де differentiation как это происходит в условиях культуры имитирует особенности видели в естественных условиях при сердечной ремоделирования10,15. Ремоделирование сердца — это ключевой процесс во время болезни сердца16. Как сердечно-сосудистых заболеваний по-прежнему являются основной причиной смерти в промышленно развитых обществах, более глубокое понимание биологии взрослых кардиомиоцитов важно (который; 2015). Изоляции и выращивания ARVC может помочь в разработке новых стратегий и лекарства для лечения сердечных заболеваний. С этой рукописи предоставляется протокол для изоляции и выращивания ARVC. Кроме того в разделе обсуждение выделяются некоторые критические части данного метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поведение взрослых кардиомиоцитов в vivo находится под влиянием многих взаимодействия с другие ячейки (например, нейроны, эндотелиальных клеток, фибробластов, воспалительных клеток) и электрические синцития, который они формируют1. Таким образом изучая стресс ада?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Надин Woitasky и Питер волк для оказания технической помощи. Кроме того Авторы благодарят г-жа Клаудия Лоренц (медицинские писатель, ACCEDIS) за помощь в подготовке рукописи. Эта рукопись была финансово поддержана DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
Referências
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
