Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement et la culture du rat adulte cardiomyocytes ventriculaires (CVDA). CVDA isolé peut être utilisé pour la culture à courte et à long terme. L’isolement et la culture de CVDA peuvent jouer un rôle clé dans l’élaboration de nouveaux schémas thérapeutiques pour les maladies cardiaques.
Abstract
Dans un coeur intact, cellules adjacentes influencent les cardiomyocytes adultes. Avec la méthode d’isolement et culture des cardiomyocytes adultes, une enquête précise sur le comportement de ces cellules sous traitements spécifiques et des environnements est possible. Ce manuscrit présente un protocole pour la réussite de l’isolement et culture des cardiomyocytes ventriculaires de rat adulte (CVDA).
Le rat est sacrifié par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Puis, le cœur est extraite et l’aorte est découvert. Par la suite, une perfusion sur le système de perfusion de Langendorff avec épuisement de calcium et le traitement de la collagénase est effectuée. Par la suite, tissu ventriculaire obtient haché, rediffusée et filtré, suivi de trois étapes de centrifugation avec ajout graduel de CaCl2 jusqu’à ce que la concentration de calcium physiologique est atteinte. CVDA sont plaquées sur les récipients de culture cellulaire. Après avoir actualisé le milieu de culture cellulaire, CVDA peut être cultivé pendant six jours, sans changer le milieu de culture contenant du sérum. Isolement de CVDA est un processus délicat de calcium. Petits changements dans la concentration de calcium intracellulaire provoque une diminution de la qualité et la viabilité des cellules isolées.
Fraîchement isolées CVDA sont en forme de tige. Dans les premiers jours de culture, ils perdent les bâtonnet morphologie et forme pseudopodes structures semblables (propagation). Au cours de cette formation morphologique CVDA dégrader initialement leurs éléments contractiles, suivies d’une réforme par le biais de fibres de stress d’actine et de novo sarcomerogenesis. Après une semaine de la culture, la plupart CVDA montrent un aspect généralisé avec une striation transversale clairement décelable. Ce processus est sensible à la concentration de calcium intracellulaire, comme traitement avec ionomycine atténue la propagation. Les marqueurs clés dans ce processus de – et re – differentiation sont la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), oncostatine M (OSM) et swiprosin-1 (EFHD2). Des études récentes ont suggéré que cardiaque re – et de – differentiation survenant dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque. Par conséquent, l’isolement et culture des CVDA jouent un rôle clé dans la compréhension de la biologie des cardiomyocytes.
Introduction
Les cardiomyocytes adultes en vivo fonctionne comme un syncytium électrique basé sur les contacts des cellules entre les myocytes. En outre, ils sont influencés par des cellules adjacentes comme les fibroblastes cardiaques, cellules endothéliales, les neurones et les cellules inflammatoires1. Afin d’étudier la capacité des cardiomyocytes à adapter leur organisation intracellulaire à modifié les conditions de charge, comme on le voit au cours de l’hypertrophie cardiaque, qui est une première étape conduisant à une insuffisance cardiaque, l’isolement et la culture du rat ventriculaire adulte cardiomyocytes (CVDA) est nécessaire2,3,4. Historiquement, les cardiomyocytes ont d’abord été isolés de l’embryon de poulet coeurs5,6. Quelques années plus tard, le premier isolement des cardiomyocytes différenciées en phase terminale a été décrite à l’aide de calcium appauvrissement de la couche7. Toutefois, ces cardiomyocytes adultes n’étaient pas calcique tolérant et ne pouvait donc pas être utilisés pour les tests fonctionnels. Enfin, en 1976, un nouveau protocole activé Powell et Twist d’enquêter sur des cardiomyocytes ventriculaires adultes sous des conditions physiologiques8. Dans un premier temps, ils ont isolement les cardiomyocytes adultes sous de faibles concentrations de calcium et par la suite une augmentation de calcium à des concentrations physiologiques dans une procédure par étapes. Aujourd’hui, la plupart des protocoles d’isolement et de culture des cardiomyocytes adultes travaillent avec ce protocole de calcium et utilisent collagénase pour la digestion enzymatique de la cellule-cellule dense contacts1.
Pour une culture réussie, sérum de veau foetal (FCS) ou oncostatine M (OSM) est requise. CVDA exécute une de – et re – differentiation avec les importants changements structurels dont sarcomère démontage et réforme9,10,11,12. Ce processus s’accompagne d’un re-expression des gènes de type fœtal, comme la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), comme dans une hypertrophie et une formation de structures ressemblant à des pseudopodes, également appelé épandage4,11, 13. en outre, swiprosin-1 (EFHD2), une protéine nouvellement identifiée, joue un rôle majeur dans le processus de re-différenciation des cultivés CVDA11. En conséquence, CVDA dans culture transformer en cellules généralisées, polymorphes, qui montrent spontanément des contractions après deux ou trois semaines dans la culture2,4,14.
Des découvertes récentes ont révélé que cardiaque re – et de – differentiation lorsqu’il produit dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque10,15. Remodelage cardiaque est un processus clé lors des maladies cardiaques,16. Comme les maladies cardiaques constituent toujours la principale cause de mortalité dans les sociétés industrialisées, il est important de mieux comprendre la biologie des cardiomyocytes adultes (qui ; 2015). Isolement et culture des CVDA peuvent aider à développer de nouvelles stratégies et médicaments pour le traitement des maladies cardiaques. Ce manuscrit, un protocole pour l’isolement et la culture de CVDA est donné. En outre, certaines parties critiques de cette méthode sont mises en évidence dans la section « discussion ».
Protocol
Representative Results
Discussion
Le comportement des cardiomyocytes adultes in vivo est influencé par de nombreuses interactions avec les autres cellules (par exemple, les neurones, les cellules endothéliales, fibroblastes, cellules inflammatoires) et le syncytium électrique qu’ils composent1. Par conséquent, étudier le stress adaptation des cardiomyocytes adultes exclusivement nécessite l’isolement et la culture de CVDA. Les principaux effets d’isoler et de cultiver CVDA sont : 1) les déconnecter …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Nadine Woitasky et Peter Volk pour l’assistance technique. En outre, les auteurs remercient Mme Claudia Lorenz (auteur médical, ACCEDIS) pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce manuscrit a été soutenu financièrement par la DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
Referências
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