Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L’isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.
Abstract
In un cuore intatto, celle adiacenti influenzano cardiomiociti adulti. Con il metodo di isolamento e coltura dei cardiomiociti adulti, è possibile una valutazione dettagliata del comportamento di queste cellule nell’ambito di trattamenti specifici e di ambienti. Questo manoscritto presenta un protocollo per l’isolamento di successo e coltivazione dei cardiomyocytes ventricolari di ratto adulto (ARVC).
Il ratto è sacrificato dalla dislocazione cervicale sotto anestesia profonda. Quindi, viene estratto il cuore e l’aorta è scoperto. Successivamente, viene eseguita aspersione sul sistema di perfusione di Langendorff con deplezione di calcio e trattamento collagenasi. In seguito, tessuto ventricolare ottiene macinata, ricircolo e filtrata, seguita da tre fasi di centrifugazione con graduale aggiunta di CaCl2 finché non viene raggiunta la concentrazione fisiologica di calcio. ARVC sono placcati su piastre di coltura delle cellule. Dopo l’aggiornamento il mezzo di coltura cellulare, ARVC può essere coltivata fino a sei giorni senza cambiare il mezzo di coltura contenente siero. Isolamento di ARVC è un processo delicato di calcio. Piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio causano una diminuzione della qualità e la vitalità delle cellule isolate.
Appena isolato ARVC sono a forma di asta. Entro i primi giorni di coltivazione perdono l’asta-a forma di forma e morfologia pseudopodi-come le strutture (diffusione). Durante questa formazione morfologica ARVC degradare inizialmente loro elementi contrattili, seguite da una riforma attraverso fibre di actina stress e de novo sarcomerogenesis. Dopo una settimana di coltivazione, la maggior parte ARVC mostrano un aspetto diffuso con una striatura trasversale chiaramente rilevabile. Questo processo è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio, come il trattamento con ionomicina attenua la diffusione. Catena pesante β-miosina (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2) sono indicatori chiavi in questo processo di de – e re – differentiation. Studi recenti hanno suggerito che cardiaco re e de differentiation che si verificano in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il ritocco cardiaco. Di conseguenza, isolamento e coltura di ARVC gioca un ruolo chiave nella comprensione della biologia dei cardiomiociti.
Introduction
Cardiomiociti adulti in vivo funziona come un sincizio elettrico basato su contatti cellula-cellula fra miociti. Inoltre, sono influenzati da celle adiacenti come fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali, neuroni e cellule infiammatorie1. Al fine di studiare la capacità dei cardiomiociti di adeguare la loro organizzazione intracellulare di alterate condizioni di carico, come si è visto durante l’ipertrofia cardiaca, che è un passo iniziale che porta a insufficienza cardiaca, l’isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC) sono necessario2,3,4. Storicamente, cardiomiociti in primo luogo sono stati isolati da pulcino embrionali cuori5,6. Pochi anni dopo, il primo isolamento di cardiomiociti terminalmente differenziati è stata descritta utilizzando calcio svuotamento7. Tuttavia, questi cardiomiociti adulti non erano calcio tollerante e non potevano essere usati per saggi funzionali. Infine, nel 1976 un nuovo protocollo abilitato Powell e Twist per indagare su cardiomiociti adulti ventricolari sotto condizioni fisiologiche8. Come primo passo, hanno isolato cardiomiociti adulti sotto le concentrazioni basse del calcio e calcio in seguito aumentato a concentrazioni fisiologiche in una procedura graduale. Oggi, maggior parte dei protocolli per l’isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti lavoro con questo protocollo di calcio e utilizzare collagenasi per la digestione enzimatica della cellula-cellula densa contatti1.
Per una coltivazione di successo, è necessario il siero fetale di vitello (FCS) o oncostatin M (OSM). ARVC eseguire un de – e re – differentiation con vasti cambiamenti strutturali tra cui sarcomero smontaggio e riforma9,10,11,12. Questo processo è accompagnato da una ri-espressione dei geni di tipo fetale, come β-miosina catena pesante (β-MHC), come noto da ipertrofia e una formazione di pseudopodi-come le strutture, anche chiamato diffusione4,11, 13. Inoltre, swiprosin-1 (EFHD2), una proteina di recente identificazione, svolge un ruolo importante nel processo di re-differenziazione di coltivato ARVC11. Di conseguenza, ARVC nella cultura trasformare nelle cellule polimorfiche, diffuse, che spontaneamente mostrano contrazioni dopo due o tre settimane nella cultura2,4,14.
Recenti scoperte hanno rivelato che cardiaco re e de differentiation come si verifica in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il rimodellamento cardiaco10,15. Rimodellamento cardiaco è un processo chiave durante malattie cardiache16. Come le malattie cardiache sono ancora la principale causa di morte nelle società industrializzate, una migliore comprensione della biologia dei cardiomiociti adulti è importante (OMS; 2015). Isolamento e coltura di ARVC può aiutare a sviluppare nuove strategie e medicinali per il trattamento delle malattie cardiache. Con questo manoscritto, un protocollo per l’isolamento e la coltura di ARVC è fornito. Inoltre, alcune parti critiche di questo metodo sono evidenziate nella sezione discussione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il comportamento di cardiomiociti adulti in vivo è influenzato da molte interazioni con altre cellule (ad es., neuroni, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule infiammatorie) e il sincizio elettrico che formano1. Pertanto, studiare esclusivamente adattamento allo stress dei cardiomiociti adulti richiede l’isolamento e la coltura di ARVC. I principali effetti di isolare e coltivare ARVC sono: 1) disconnetterli dalla matrice extracellulare e contatti cellula-cellula; 2) eseguire…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Nadine Woitasky e Peter Volk per assistenza tecnica. Inoltre, gli autori ringraziano la signora Claudia Lorenz (scrittore medico, ACCEDIS) per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente da DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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