Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes
Summary
Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.
Abstract
Astrozyten sind die wichtigen Zelltyp im Gehirn und Synapsen und Blutgefäße direkt zu kontaktieren. Obwohl Mikroglia-Zellen die wichtigsten Immunzellen und nur Fresszellen im Gehirn betrachtet, haben neuere Studien gezeigt, dass Astrozyten auch Teilnahme an verschiedenen phagocytic Prozesse, z. B. Entwicklungsstörungen Synapse Beseitigung und Clearance von Beta Amyloid-Plaques bei Alzheimer-Krankheit (AD). Trotz dieser Erkenntnisse ist die Effizienz der Astrozyten Engulfment und Abbau ihrer Ziele unklar im Vergleich mit der Mikroglia. Dieser Mangel an Informationen ist meist aufgrund des Fehlens von einem Testsystem, in denen die Kinetik der Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose sind leicht vergleichbar. Um dieses Ziel zu erreichen, entwickelten wir einen langfristige live-Imaging in Vitro Phagozytose Assay zur Bewertung der phagocytic Kapazität der gereinigten Astrozyten und Mikroglia. In diesem Test ist Echtzeit-Erkennung von Engulfment und Abbau möglich mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes, die leuchtend rote Fluoreszenz in sauren Organellen, wie Lysosomen abgeben. Unsere neuartige Assay bietet einfache und effektive Erkennung von Phagozytose durch live-Imaging. Darüber hinaus kann dieser in-vitro- Phagozytose Assay als Screening-Plattform verwendet werden, um zu identifizieren, Chemikalien und Substanzen, die zu verbessern oder hemmen die phagocytic Kapazität der Astrozyten. Wie synaptic Pruning Fehlfunktion und Pathogene Protein Akkumulation gezeigt wurden, psychischen Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen verursachen, sollte Chemikalien und Substanzen, die die phagocytic Kapazität von Gliazellen modulieren hilfreich bei der Behandlung von verschiedenen neurologische Erkrankungen.
Introduction
Gliazellen, die nicht leicht erregbaren Zellen im Gehirn beziehen, sind die wichtigen Zelltyp in das zentrale Nervensystem (ZNS). Zuvor galten Gliazellen als bloße Stützzellen, die vor allem passive Rollen bei der Aufrechterhaltung neuronaler überleben und basalen synaptischen Eigenschaften spielen. Anzeichen dafür ergab jedoch, dass Gliazellen in verschiedene Aspekte der Neurobiologie, wie Gehirn Homöostase, Vermittlung von Synapse Bildung1,2,3 und Synapse eine aktivere Rolle spielen Beseitigung4,5, und modulierenden synaptische Plastizität6,7. Gliazellen des ZNS gehören Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Zwischen diesen Zellen, Astrozyten und Mikroglia haben gezeigt, dass phagocytic Rollen zu spielen, indem Sie verschlingen Synapsen4,5, apoptotischen Zellen8, neuronale Trümmer9und Pathogene Proteine wie Amyloid beta Plaketten10,11. In das sich entwickelnde Gehirn beseitigen Astrozyten Synapsen im dorsalen seitlichen gekniet Nucleus (CGN) durch MERTK und MEGF10-abhängige Phagozytose4. In ähnlicher Weise Mikroglia auch beseitigen C1q-beschichtete Synapsen während Entwicklungsstadien durch die klassische Ergänzung Kaskade5. Interessanterweise wurde vermutet, dass Mängel in Synapse beschneiden einer der Initiatoren von verschiedenen neurologischen Störungen sein können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Mutationen in Ergänzung Komponente 4 (C4), die Ergänzung-vermittelten Synapse Beschneiden von Mikroglia zunimmt, eng mit der Prävalenz von Schizophrenie in Menschen12 sind. Eine neuere Arbeit hat auch gezeigt, dass die klassische Ergänzung Bahn Überaktivierung in der Einleitung von AD und frühem Verlust der Synapse in dieser Krankheit13induziert.
Verglichen mit Mikroglia-vermittelten Phagozytose, ob Astrozyten vermittelt Phagozytose, die Initiierung und Progression von verschiedenen neurologischen Erkrankungen beiträgt, ist weniger klar. Eine neuere Arbeit legt jedoch nahe, dass Faktoren, die die Rate der normalen Synapse Beschneidung von Astrozyten verändern können Gehirn Homöostase zu stören und zu AD Anfälligkeit und Pathologie14beitragen. Die Rate der Synapse Beschneidung von Astrozyten steuert kraftvoll ApoE -Isomere, mit einer schützenden Allel für AD (ApoE2) stark erhöhen die Rate und eine Risiko-Allel für AD (ApoE4) die Rate deutlich zu senken. Darüber hinaus angesammelt transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck ApoE4 viel mehr synaptische C1q als Kontrolle oder ApoE2 Mäuse14. Diese Daten deuten darauf hin, dass Sehbehinderte Astrozyten vermittelt Phagozytose in den frühen AD Gehirn kann induzieren die Anhäufung der alternde C1q-beschichtete Synapsen/synaptische Trümmer, die Ergänzung-vermittelten Mikroglia Phagozytose, fahren synaptischen Degeneration aktiviert . Die beeinträchtigte phagocytic Kapazität der Astrozyten in ApoE4 Trägern kann auch die unkontrollierte Anhäufung von Beta Amyloid-Plaques im Gehirn AD betroffen beitragen.
Darüber hinaus hat gezeigt, dass Gliazellen im Gehirn im Alter von Drosophila ihre phagocytic Kapazität aufgrund der verringerten Übersetzung von Draper, ein Homolog des Megf10 , die Astrozyten verwenden verlieren für phagocytosing Synapsen. Wiederherstellen von Draper Ebenen gerettet phagocytic Kapazität von Gliazellen, die effizient beschädigte axonalen Schutt im alten Gehirn in ähnlichem Ausmaß wie im jungen Gehirn darauf hinweist, dass Altern ausgeglichen-induzierte Veränderungen in der phagocytic Kapazität von Astrozyten können zu Störungen des Gehirns Homöostase15beitragen.
Möglicherweise modulieren die phagocytic Kapazität der Astrozyten basierend auf diese neuen Erkenntnisse, eine attraktive therapeutische Strategie zur Vorbeugung und Behandlung von verschiedenen neurologischen Erkrankungen. In diesem Zusammenhang gab es mehrere Versuche, phagocytic Astrozyten, beispielsweise verstärkt durch Induktion Versauerung der Lysosomen mit sauren Nanopartikel16 und überexprimierenden Transkriptionsfaktor EB (TFEB), die erhöhen können Lysosomen Biogenese17. Trotz dieser Bemühungen ist noch unklar, wie Astrozyten und Mikroglia-Zellen unterscheiden sich in ihrer phagocytic Kinetik und ob wir erhöhen oder verringern Sie ihre phagocytic Kapazitäten bei verschiedenen Erkrankungen sollten.
In diesem Beitrag präsentieren wir eine neuartige in-vitro- Test zur Erkennung von phagocytic Kapazität der Astrozyten in Echtzeit. Die Daten zeigen unterschiedliche Kinetik der Engulfment und Abbau in Astrozyten und Mikroglia. Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), die von Astrozyten sezernierten Faktoren enthält, ist essentiell für effektive Phagozytose von Astrozyten und Mikroglia. Darüber hinaus spielt Megf10, einen phagocytic Rezeptor in Astrozyten und ein Homolog von Ced-1 und Draper, wichtige Rollen in Astrozyten vermittelt Phagozytose8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel präsentieren wir Methoden für einen langfristigen live-Imaging in Vitro Phagozytose-Assay mit gereinigtem Gliazellen und pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes. Wir zeigen, dass im Vergleich zu Mikroglia, Astrozyten besitzen unterschiedlichen Engulfment und Abbau Kapazität während der Phagozytose von Synaptosomes. Darüber hinaus unsere Daten deuten darauf hin, dass Astrozyten abgesondert Faktoren, die Überbrückung Moleküle wie GAS6, Proteine und MEGE8 enthalten, entscheidend für effizien…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Yeon-Joo Jung für ihre experimentelle Unterstützung während Synaptosome Reinigung und Jungjoo Park für Bilder von Synaptosomes mit PS-Exposition. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern in chungs Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 und NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
Referências
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