סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids
Summary
פרוטוקול המתואר לסינתזה ידנית של oligo-peptoids ואחריו רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.
Abstract
Peptoids הם שבשליטת רצף מחקה-פפטיד oligomers המורכב מיחידות N alkylated גליצין. בין יישומים פוטנציאליים רבים, peptoids חשב כסוג של אחסון מידע מולקולרית. ניתוח ספקטרומטר מסה נחשב לשיטת הבחירה עבור רצף peptoids. Peptoids יכול להיות מסונתז באמצעות הכימיה מעבדתי באמצעות מעגל התגובה החוזרת בשני שלבים. כאן אנו מציגים שיטה לסנתז באופן ידני oligo-peptoids, כדי לנתח את רצף peptoids באמצעות טכניקות ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם. Peptoid לדוגמה הוא nonamer המורכבת לסירוגין N-(2-methyloxyethyl) גליצין (Nme) ו N-(2-phenylethyl) גליצין (Npe), וכן של N-(2-aminoethyl) גליצין (נאה)-קצה אמיני. הנוסחה רצף של peptoid אצמנ Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, Ac קבוצת אצטיל. הסינתזה מתרחש כלי זמין מסחרית מוצק-שלב התגובה. השרף אמיד רינק משמש את התמיכה מוצק להניב את peptoid עם קבוצת אמיד-קצה קרבוקסילי. Peptoid ובמוצר נענשים רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה טריפל-פאול מצמידים אל מקור יינון ספקטרומטריית electrospray. המדידה MS/MS מייצרת קשת של יונים שבר הנובע הדיסוציאציה של peptoid טעון. היונים פרגמנט מסודרים בהתבסס על הערכים של היחס בנפח גדול לתשלום (מ/z). הערכים מ/z של היונים פרגמנט מושווים כנגד ההמונים הנומינלי של יונים פרגמנט תיאורטית החזוי, על פי התכנית של פיצול peptoid. הניתוח יוצר תבנית פיצול של peptoid טעון. תבנית פיצול הוא מתואם רצף מונומר של peptoid נייטרלית. בהקשר זה, ניתוח MS קורא את המידע רצף של peptoids.
Introduction
Peptoids הם סוג של פולימרים שבשליטת רצף עם מבני עמוד השדרה מחקה את המבנה של פפטידים. Peptoids יכול להיות מסונתז מן אמינים מגוונים, המאפשרת peptoids שהפגינו מאפיינים מאוד tunable1,2. Peptoids שימשו כמודלים מולקולרי לצורך מחקר biophysical, נחשב סוכני טיפולית, תוכנן ליגנדים חלבונים3,4,5,6. Peptoids פותחו במגוון רחב של חומרים פעילים ביולוגית, כגון חומרים מימטי-נוגדן anti-עכירות, סוכני מיקרוביאלית האנזימים מעכבי7,8,9. עם אופי מאוד מסודרת, tunable, peptoids גם חשב כסוג של אחסון מידע מולקולרית10. הגילוי של יישומים מגוונים אלה דורש פיתוח שיטות אנליטיות יעיל כדי לאפיין את הרצף והמבנה של peptoids. טכניקות מבוססות ספקטרומטר מסה tandem הראו הבטחה כי השיטה של בחירה עבור ניתוח המאפיינים רצף של פולימרים שבשליטת רצף, כולל12,11,peptoids13, 14,15. עם זאת, מחקרים שיטתיים מתאם הדפוסים יון peptoid הפיצול הנובע מסה ספקטרומטר מחקרים, המידע המבני של peptoids מוגבלים מאוד.
Peptoids יכול להיות בקלות מסונתז באמצעות שיטה מעבדתי. השיטה מפותח כרוך איטראציה של שני שלבים מונומר תוספת מחזור16,17. במחזור כל תוספת, אמין מאוגד-שרף הוא acetylated על ידי haloacetic חומצה (בדרך כלל bromoacetic, BMA), זה מלווה תגובת הדחק עם אמין ראשי. למרות פרוטוקולים אוטומטיים סינתזה הוחלו באופן שגרתי של סינתזה peptoid, peptoids יכול להיות מסונתז באופן ידני עם תשואות מצוינות כימיה סטנדרטי מעבדה16,18,19, 20.
המעבדה שלנו אימצו את השיטה של סינתזה peptoid ידנית, פשוטה את המנגנון בשימוש השיטות הקיימות. בעבר למדנו את דפוסי פיצול של סדרת peptoids באמצעות MS/MS טכניקות21,22,23. התוצאות שלנו מראים כי peptoids לייצר fragmentations האופייני כאשר הם נחשפים התנגשות-induced דיסוציאציה (CID)21,23 או לכידת אלקטרון דיסוציאציה (ECD)22 ניסויים. במאמר זה נדגים כיצד oligo-peptoids יכול להיות מסונתז במעבדה לכימיה סטנדרטי, כיצד לבצע את הניסויים CID באמצעות ספקטרומטר מסה טריפל-פאול וכיצד לנתח את הנתונים ספקטרלי. Peptoid כדי להיות מסונתז והוא מאופיין הוא nonamer עם acetylation N-מסוף, amidation C-מסוף, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. המבנה של peptoid מוצג באיור1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, יש להיות מסונתז באמצעות פרוטוקול שהוצג. מנגנון סינתזה כרוך כלי דמוי מזרק פוליפרופילן מוצק-שלב התגובה מטרף מכני. כלי התגובה הם זמינים מסחרית בעלות נמוכה. מכני מטרף הוא מנגנון משותף במעבדות הכימיה. עם השימוש של כלי דמוי מזרק התגובה, פתרונות יכולים להיות נשא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות מר מייקל קונלי, ד ר רונלד צוקרמן (יציקה מולקולרית, המעבדה הלאומית לורנס ברקלי) על טכניקה תמיכה סינתזה peptoid. אנו להכיר התמיכה של הקרן הלאומית למדע (צ’ה-1301505). ספקטרומטר מסה כל הניסויים נערכו במתקן ספקטרומטר מסה של הכימיה באוניברסיטה של האוקיינוס השקט.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
Referências
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
