Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids
Summary
Ett protokoll som beskrivs för manuell syntesen av oligo-peptoids följt av sekvensanalys av masspektrometri.
Abstract
Peptoids är kontrollerad sekvens peptid-härma oligomerer bestående av N-alkylerade glycin enheter. Bland många potentiella tillämpningar, har peptoids varit tänkt som en typ av molekylär informationslagring. Masspektrometri analys har ansetts metoden för val av sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseras via fasta fasen kemi använder en upprepande two-step reaktion cykel. Här presenterar vi en metod att syntetisera manuellt oligo-peptoids och analysera sekvensen av den peptoids med tandem masspektrometri (MS/MS) tekniker. Den prov-peptoid är en nonamer bestående av omväxlande N-(2-methyloxyethyl) glycin (Nme) och N-(2-phenylethyl) glycin (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glycin (Nae) vid N-terminalen. Sekvens formeln för peptoid är Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, där Ac är gruppen acetyl. Syntesen sker i ett kommersiellt tillgängliga fasta fasen reaktionskärl. Rink amide kådan används som fasta stöd för att ge peptoid med en amid-gruppen vid C-terminus. Peptoid produkten utsätts för sekvensanalys använder en triple-quadrupole masspektrometer kopplad till en elektrospray jonisering källa. MS/MS mätningen producerar ett spektrum av fragmentet joner följd dissociationen av laddade peptoid. Fragmentet jonerna sorteras baserat på värdena i sin massa-till-storma baserat (m/z). De m/z-värdena av fragmentet joner jämförs nominella massorna av teoretiskt förväntade fragment joner, enligt systematiken i peptoid fragmentering. Analysen genererar en fragmentering mönster av den laddade peptoid. Den fragmentering mönstret är korrelerad till monomer sekvensen av den neutrala peptoid. I detta avseende läser MS analys ut informationen om sekvensen av peptoids.
Introduction
Peptoids är en klass av sekvens-kontrollerade polymerer med ryggraden strukturer som efterliknar strukturen i peptider. Peptoids kan syntetiseras från olika aminer, som gör peptoids att uppvisa mycket avstämbara boenden1,2. Peptoids har använts som molekylära modeller för biofysiska forskning, anses vara terapeutiska medel, och utformade som ligander för proteiner3,4,5,6. Peptoids har utvecklats till en mängd biologiskt aktiva föreningar, såsom antifouling och antikropp-mimetiska material, antimikrobiella medel och enzym-hämmare7,8,9. Med en mycket ordnad och avstämbara natur, har peptoids också varit tänkt som en typ av molekylär information lagring10. Upptäckten av dessa applikationsmöjligheter efterlyser utveckling av effektiva analysmetoder att karakterisera sekvensen och strukturera av peptoids. Tandem mass spectrometry-baserade tekniker har visat lovande resultat som metoden för val av analysera egenskaperna sekvens för sekvens-kontrollerade polymerer, inklusive peptoids11,12,13, 14,15. Dock systematiska studier korrelerar peptoid ion fragmentering mönster följd mass spectrometry studier och strukturell information av peptoids är mycket begränsade.
Peptoids kan syntetiseras lätt med en fast fas metod. Väl utvecklade metoden innebär en iteration av en två-stegs monomer tillägg cykel16,17. I varje tillägg cykel, en hartsa-begränsar Amin är acetylerade av en haloacetic syra (vanligtvis bromacetat, BMA) och detta följs av en förskjutning reaktion med en primär Amin. Även om automatiserad syntes protokoll har tillämpats rutinmässigt för peptoid syntes, kan peptoids syntetiseras manuellt med utmärkt avkastning i en standard kemi laboratoriet16,18,19, 20.
Vårt labb har antagit metoden för manuell peptoid syntes och förenklat den apparat som används i de befintliga metoderna. Vi har tidigare studerat fragmentering mönster i en serie av peptoids med MS/MS tekniker21,22,23. Våra resultat visar att peptoids producerar karakteristiska splittringarna när de utsätts för kollision-inducerad dissociation (CID)21,23 eller electron capture dissociation (ECD)22 experiment. I den här artikeln visar vi hur oligo-peptoids kan syntetiseras i en standard kemilaboratorium, hur du utför de CID experiment med en trippel-quadrupole masspektrometer och hur att analysera spektrala data. Peptoid syntetiseras och kännetecknas är en nonamer med N-terminala acetylering och C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Peptoid struktur visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, har syntetiserats använda protokollet presenteras. Syntes apparaten innebär en spruta-liknande polypropylen fasta fasen reaktionskärlet och en mekanisk skakapparat. Reaktionskärl är kommersiellt tillgängliga och låg kostnad. En mekanisk skakapparat är en gemensam apparatur i kemi laboratorier. Med användning av en spruta-liknande reaktionskärlet, kan lösningar dras in och sköt ur fartyget genom att manuellt flytta kolven. Denna teknik tillåter …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Mr Michael Connolly och Dr Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) för teknik som stöd i peptoid syntes. Vi erkänner stöd från National Science Foundation (CHE-1301505). Alla masspektrometri experiment genomfördes i kemi Mass Spectrometry anläggningen vid universitetet i Stilla havet.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
Referências
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
