Etablering af en ekstracellulære sure pH kultur System
Summary
Sure tumor mikromiljø spiller vigtige roller i tumor progression. For at vurdere virkningerne af sure ekstracellulære pH på kræft celler in vitro etableret vi enkle sure kultur systemer.
Abstract
Betingelserne for tumor mikromiljø hypoxi f.eks næringsstof sult, spiller en kritisk rolle i kræft progression og malignitet. Men rollen som sure ekstracellulære pH i tumor aggressivitet og dens underliggende mekanisme har ikke blevet grundigt undersøgt i forhold til hypoksiske eller næringsstof sult betingelser. Derudover er en veldefineret kultur metode til at efterligne den sure ekstracellulære tumor mikromiljø ikke blevet fuldt rapporteret.
Her præsenterer vi en simpel i vitro kultur metode for at opretholde sure ekstracellulære pH bruge reduceret bikarbonat og øget laktat eller HCl-koncentrationer i dyrkningsmediet. Medium pH blev opretholdt i mindst 24 timer og gradvist faldt med 72 h efter kultur af PANC-1 og AsPC-1 bugspytkirtelkræftceller. Tre særskilte sure media betingelser i denne undersøgelse meget upregulated pH-responderende gener såsom MSMO1, INSIG1og IDI1 sammenlignet med hypoxi eller næringsstof sult. Opregulering af disse gener kan bruges som markør af sure pH-værdi. Disse enkle teknikker er gavnligt at belyse underliggende mekanismer af tumor malignitet under sure tumor mikromiljø. Derfor vores ekstracellulære sure pH kultur system giver mulighed for opdagelsen af cellulære sure pH svar ikke kun i kræftceller, men også i primærelementer, såsom renal tubulær celler, i forhold til de andre sure lidelser herunder, diabetisk Ketoacidose, mælkesyre acidose, renal tubulær acidose og respiratorisk acidose.
Introduction
Tumor mikromiljø spiller vigtige roller i tumor progression og kræft celle metabolisme1,2,3. Kræftceller er ofte udsat for betingelser såsom hypoxi, næringsrige afsavn og sure ekstracellulære pH (pHe). Dog rollen som pHe i tumor progression ikke blevet afklaret så udførligt som hypoxi eller næringsstof sult. PHe i tumor væv kan blive sure, nåede ca pH 6,84,5. Sure pH-værdi udspringer af aerobe og anaerobe glycolytic udskillelse af protoner (H+) og laktat af prolifererende kræft celler5,6.
Nylige undersøgelser afslørede, at sure pHe-induceret Histon deacetylation, fedtsyre oxidation og exocytose af sure lysosomer for tilpasning til den alvorlige sure miljø7,8,9,10. Men mekanismer gennem hvilke ekstracellulære forsuring påvirker kræft adfærd og identiteten af nøglen lovgivere i sure pH tumor mikromiljø ikke har fastlagt fuldt ud. Desuden flere rapporter beskrevet forskellige sure pH medier ved hjælp af uklare koncentrationer af bikarbonat, Tris, rør og HEPES buffer eller laktat og HCl, men der er få rapporter at demonstrere stabilitet af den justerede medium eller omfattende sammenligning af flere forskellige sure dyrkningsmedier7,8,9,10
For at belyse centrale regulatorer og metaboliske ændringer i kræftceller i forbindelse med ekstracellulære forsuring, vi etableret en simpel i vitro kultur model for at bevare en sure pHe og undersøgt rollen af pHe i kræft celler11. Du bruger denne metode, vi opretholdt en sure næringssubstratet med en pHe af 6,8 ved 37 ° C under 5% CO2, ved hjælp af reducerede bikarbonat koncentrationer i dyrkningsmediet. pH 7,4 blev brugt som normalt og styre medium. Medium pH blev opretholdt i mindst 24 timer og gradvist faldt 72 h i kultur af PANC-1 og AsPC-1 bugspytkirtelkræftceller. Fordi øget glykolyse accelererer udskillelsen af protoner, men også laktat7,8,9, vi også etableret en kultur metode efterligne laktat-induceret acidose ved tilføjelse af laktat i stedet for at reducere den bikarbonat koncentration. Derudover HCl-induceret sure pHe i mediet giver os mulighed at udelukke muligheden for, at cellulære svar til sure pH næringssubstratet ikke er på grund af en nedsat koncentration af bikarbonat. Desuden kan ved hjælp af forskellige medier med en pH på 6,4 til 7.4 med forskellige bikarbonat koncentration, vi vurdere omfanget af pHe effekter på cellulære svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrev vi en simpel sure pH kultur system og dets evalueringsprocessen. Kombinationen af tre metoder til medium forsuring, dvs, reduceret bikarbonat koncentration, laktat tilsætning og HCl tilsætning, gjort det muligt at efterforske mekanismen, pH-svar grundigt og sammenligne den cellulære reaktion på andre tumor microenvironmental betingelser såsom hypoksi eller næringsstof sult.
Nøglen til denne metode er at fastslå de relevante koncentrationer af bikarbonat, laktat og…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke medlemmerne af Division af genom videnskab og laboratorium for Systembiologi og medicin, RCAST, The University of Tokyo. Vi især takke Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida, og Dr. A.
Kunisato (Carstens Hakko Kirin Co, Ltd) til nyttige diskussioner og støtte. Dette arbejde blev delvist støttet af licensbetaling for unge videnskabsmand (A) (26710005, T.O.), licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (26116711 og 16 H 01567, T.O.) og licensbetaling for udfordrende
Sonderende forskning (16. K 14605, T.O.) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan, Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi grundlaget for kræftforskning (T.O.) og projekt for kræftforskning, og Terapeutiske Evolution (P-skabe) og den praktiske forskning for Innovative kræft kontrol fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED (T.O.).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
Referências
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
