Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması
Summary
Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.
Abstract
Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.
Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.
Introduction
Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.84,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H+) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından5,6hücreler.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya o asidik pHe kaynaklı Histon deasetilasyonu, yağ asidi oksidasyon ve ağır asidik ortamı7,8,9,10adaptasyon için asidik organellerin ekzositozu. Ancak, mekanizmalar aracılığıyla hangi hücre dışı asitleştirme kanser davranış ve düzenleyiciler asidik pH tümör microenvironment içinde tam olarak tespit anahtar kimliğini etkiler. Ayrıca, çeşitli raporlar bikarbonat, Tris, borular ve HEPES tampon veya laktat ve HCl belirsiz konsantrasyonları kullanarak çeşitli asidik pH medya açıklanan, ancak kararlılığını ayarlanan orta ne de kapsamlı göstermek için birkaç rapor vardır: birkaç farklı asidik kültür media7,8,9,10 karşılaştırılması
Anahtar düzenleyiciler ve kanser hücrelerinin hücre dışı asitleştirme bağlamında metabolik değişiklikler aydınlatmak için kurulan bir asidik pHe korumak için basit vitro kültür manken ve pHe kanser hücreleri11‘ deki rolü inceledi. Bu yöntemi kullanarak, biz tutulan 37 ° c altında %5 6,8 pHe ile asidik bir kültür orta düşük bikarbonat konsantrasyonu kültür ortamı kullanarak CO2. pH 7.4 normal olarak kullanılan ve orta kontrol. Orta pH en az 24 saat sürekli ve 72 h PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücre kültür sırasında yavaş yavaş azaldı. Gelişmiş Glikoliz sadece da laktat7,8,9proton atılımı hızlandırır çünkü aynı zamanda asidoz laktat kaynaklı yerine laktat ekleme azaltarak tarafından taklit eden bir kültür yöntemi kurdu bikarbonat konsantrasyonu. Ayrıca, HCl kaynaklı asidik pHe orta asidik pH kültür ortamına hücresel yanıt bikarbonat azaltılmış bir konsantrasyon nedeniyle değildir olasılığını dışlamak için bize izin verir. Ayrıca, 6.4-7,4 farklı bikarbonat konsantrasyonu ile pH ile çeşitli medya kullanarak, biz ölçüde hücresel yanıt pHe efektleri değerlendirebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.
Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Division genom bilim ve laboratuvar üyeleri teşekkür sistemleri Biyoloji ve tıp, RCAST, Tokyo Üniversitesi için. Biz özellikle teşekkür Dr H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, Tokyo Üniversitesi), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida ve Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd) yararlı tartışmalar ve destek. Bu eser kısmen için genç bilim adamı (A) (26710005, T.O.), yenilikçi alanları (26116711 ve 16 H 01567, T.O.) bilimsel araştırma için Grant-in-Aid ve Grant-in-Aid için zorlu Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir
Araştırmacı araştırma (16K 14605, T.O.) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya, Takeda Bilim Vakfı (to), kanser araştırmaları (to) Kobayashi temeli ve kanser araştırmaları için proje ve Terapötik evrim (P-oluşturma) ve yenilikçi kanserle savaş Japonya ajansı tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED (to) için pratik araştırma.
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
Referências
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
