雌性生殖道交配后精子的收集及对小鼠精子液化的测定
Summary
精子的液化需要从精凝胶中解放出来。本研究提供了从雌性生殖道 post-coitus 中收集精子, 以及测定精子液化时间的程序。
Abstract
在小鼠体内, 被射出的精子在子宫内沉积。射精后, 精子的一致性从凝胶状变为水样, 这一过程称为液化。在这项研究中, 我们展示了如何收集 post-ejaculated 精子从女性生殖道在一个小鼠模型。首先, 发情阶段的成年雌性老鼠在一夜之间被安置在一个雄性笼子里。第二天早上, 交配被证实的交配插头在阴道开口。交配插头的雌性小鼠被安乐死, 每个生殖道都被收集成一个整体 (阴道、子宫、输卵管、卵巢), 确保一个封闭的系统来控制精子。生殖道被放置在1.5 毫升离心管, 阴道被切断, 以释放的精子进入管。为了保证最大的精子量进行分析, 用无牙钳将子宫角从卵巢端挤压到阴道末端, 排出残余的精子。整个生殖道被丢弃。该精子管被短暂剥离。25μ l 毛细管吸管被放置在一个180°角 (平行于管壁) 管。记录了在25μ l 线上填充毛细管所用的时间。从一个成熟的雄性饲养者的精子通常需要大约60-180 秒来填满25μ l 毛细管。这种精子收集技术也可用于其他下游应用, 如精象和运动分析。
Introduction
雌性生殖道由上部和下层组成。上生殖道包括输卵管、子宫和宫颈。下生殖道包括 ectocervix 和阴道。在人类, 被射出的精子沉积在阴道前壁, 毗邻 ectocervix1。然而, 在小鼠体内, 精子在交配2后几分钟内就会被扫入子宫。
精子含有精凝胶, 在射精的几秒钟内凝固, 导致精子被诱捕并固定在3。液化释放的固定精子通过改变精子从凝胶状到水样的一致性。这一过程对精子的运动和哺乳动物的繁殖至关重要。关于精子液化的知识主要是基于体外研究, 其中精子在培养皿中液化。在人类中, 前列腺特异抗原或 PSA (也称为激肽释放酶相关的肽3或 KLK3) 的酵素活性是通过水解 semenogelins (在精子中存在凝胶形成的蛋白质) 来液化的主要贡献者4 ,5,6。降解 semenogelins 释放精子从精物, 增加精子的流动性。自由精子游向输卵管, 使卵子受精。液化 (或精子粘度) 试验是标准的初步筛查精子分析的生殖诊所, 以评估男性生育能力7。
最近发表的一篇文章表明 , 从雌性小鼠生殖道 post – mating 中收集到的的分析可以用来说明液化的不足 , 从而导致生育缺陷8。有缺陷的液化, 如精子高, 导致 11.8-32.3% 的男性不育症患者的9, 表明正常的液化是必不可少的哺乳动物繁殖。然而, 对液化缺陷的研究和处理完全集中在男性7。女性生殖道在精子液化中发挥作用的可能性尚未得到探讨。因此, 收集和测定液化时间的方法将为研究人员提供一种新的诊断工具, 以确定液化是否可能是模型机体中不育的原因之一。
Protocol
Representative Results
Discussion
从小鼠子宫收集精子可以提供优于精子分析的优势体外, 因为前者可以说明精子与女性生殖道分泌物之间的生理相互作用.在这项研究中提出的技术使研究人员能够确定精子的质量, 以及在理想的生理条件下的活力和活力。此外, 还有各种各样的下游分析, 可以使用从子宫收集的精子, 例如, 精子可以计数, 以确定实际精子数进入子宫和精子也可以成像的运动化验。理想的时间点收集精子?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了兽医学院 (立) 启动基金对 WW 的支持。作者感谢塞拉奥尔森 (立) 对这篇手稿的批判性阅读。
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
Referências
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
