Samling etter parring sæd fra kvinnelige skjede og måling av sæd LNG i mus
Summary
Sæd LNG kreves for sædcellene å bli frigjort fra banebrytende gel. Denne studien gir prosedyrer for innsamling av sæd fra den kvinnelige skjede etter samleie og måle sæd LNG tid.
Abstract
I mus, settes utbrøt sæd inn i livmoren. Etter utløsning, sæd endres konsistens fra gel-lignende til vannaktig, en prosess som kalles LNG. I denne studien viser vi hvordan du samler etter utbrøt sæd fra den kvinnelige skjede i en musemodell. Første, voksen kvinnelig mus i estrus scenen ble plassert i en mannlig bur over natten. Neste morgen, bekrefter copulation tilstedeværelsen av copulatory plug ved skjedeåpningen. Kvinnelige mus med copulatory plugger ble euthanized, og hver skjede var samlet som helhet (vagina, livmor, oviducts, eggstokkene), sikrer et lukket system inneholder sæd. Skjede ble plassert i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og skjeden ble avskåret for å løslate sæd inn i røret. For å sikre maksimal sæd volum for analyse, ble tannløs tang brukt til å presse livmor hornene fra eggstokkene slutten vaginal slutten utviste gjenværende sæd. Det hele skjede ble deretter forkastet. Sæd inneholder røret ble kort spunnet ned. En 25 μL kapillær pipette ble satt inn i røret i 180° vinkel (parallell til veggen rør). Tiden som brukes til å fylle kapillær røret til 25 μL linjen ble registrert. Sæd fra en bevist mannlige oppdretter tar vanligvis ca 60-180 s å fylle en 25 μL kapillær rør. Denne sæd samling teknikken kan også brukes i andre nedstrøms programmer som sperm bildebehandling og motilitet analyse.
Introduction
Den kvinnelige skjede består av de øvre og nedre områder. Den øvre reproduktive område inkluderer Fallopian rør og livmoren i livmorhalsen. Den lavere skjede inkluderer ectocervix og vagina. Hos mennesker brukes utbrøt sæd på fremre veggen av skjeden, tilstøtende til ectocervix1. I mus, men er semen feiet inn i livmoren minutter etter mating2.
Inneholder sæd seminal gel som er styrket innen sekunder etter utløsning, forårsaker sæd å bli fanget og immobilisert3. LNG utgivelser immobilisert sæd ved å endre sæd fra en gel-lignende til en vannaktig konsistens. Denne prosessen er avgjørende for Spermiemotilitet og pattedyr reproduksjon. Kunnskap om sæd LNG er hovedsakelig basert på i vitro studier der sæd blir flytende i en kultur parabol. Hos mennesker er den enzymatiske aktiviteten av prostata spesifikke antigen eller PSA (også kjent som kallikrein-relaterte peptidase 3 eller KLK3) den viktigste bidragsyteren for LNG gjennom hydrolyse av semenogelins (gel-forming proteiner i sæd)4 ,5,6. Nedbrytning av semenogelins utvikles sperm fra den banebrytende coagulum, øke sæd mobilitet. Frigjort sperm svømme mot Fallopian tube å befrukte egget. LNG (eller sæd viskositet) testene er en av de standard første screenings for semen analyse i fruktbarhet klinikker å vurdere mannlig fertilitet7.
En nylig publisert artikkel viser at analyse av seminal væske fra kvinnelige musen skjede etter mating kan brukes til å illustrere en mangel på LNG som kan deretter føre fruktbarhet defekter8. Defekt LNG som sæd hyperviscosity bidrar til 11,8-32,3% av ufruktbar tilfeller i menn9, antyder at normal LNG er uunnværlig for pattedyr reproduksjon. Men har studier og behandling av LNG defekter fokusert utelukkende på mannlige7. Muligheten for at den kvinnelige skjede spiller en rolle i sæd LNG har ikke blitt utforsket. Derfor vil metodene for semen samling og måling LNG tid gi forskerne en roman Diagnoseverktøy for å fastslå om LNG kan være en av årsakene til ufruktbarhet i modellen organismen rundt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samle sæd fra mus uteri kan gi fordeler over semen analyse i vitro som tidligere kan illustrere fysiologiske samspillet mellom sæd og sekret fra den kvinnelige skjede. Teknikker som presenteres i denne studien at forskerne å avgjøre sædkvalitet samt sperm levedyktighet og motilitet i ideelle fysiologiske forhold. Videre finnes det forskjellige nedstrøms analyser som utføres med sæd fra uteri, for eksempel sperm kan bli regnet for å fastslå hvor faktiske sæd inn i livmoren og sperm kan også a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av College av Veterinary medisin (WSU) oppstart fondet WW. Forfatterne takker Sierra Olsen (WSU) for kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
Referências
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
