Studie van In Vivo Glucose metabolisme in High-fat dieet-gevoed muizen met behulp van orale Glucose tolerantie Test (OGTT) en insuline tolerantie Test (ITT)
Summary
Het huidige artikel beschrijft het genereren en metabole karakterisering van vetrijke dieet-gevoed muizen als een model van dieet-geïnduceerde insulineresistentie en overgewicht. Het beschikt verder over gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van de orale glucose tolerantie test en de insuline tolerantie test, toezicht op de gehele lichaam wijzigingen van het glucose metabolisme in vivo.
Abstract
Obesitas vertegenwoordigt de belangrijkste risico factor in de pathogenese van type 2 diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door een weerstand tegen insuline-gestimuleerd glucose-opname- en een bruto decompensation van systemische glucose metabolisme. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrip van het glucose metabolisme blijven de moleculaire mechanismen van de verordening in gezondheid en ziekte onder-onderzocht, terwijl nieuwe benaderingen voor preventie en behandeling van diabetes zijn dringend noodzakelijk. Dieet afgeleide glucose stimuleert de alvleesklier secretie van insuline, die fungeert als de belangrijkste regulator van cellulaire anabole processen tijdens de gevoed statuswaarden en dus sluitend bloedglucose niveaus om systemische energie status te handhaven. Chronische overvoeren triggers meta-ontsteking, die tot veranderingen in het perifere insuline receptor-associated leidt signaling en dus vermindert de gevoeligheid voor insuline-gemedieerde glucose verwijdering. Deze gebeurtenissen uiteindelijk resulteren in verhoogde nuchtere glucose en insulineniveaus, alsmede een vermindering in de glucosetolerantie, die op zijn beurt als belangrijke indicatoren van insulineresistentie fungeren. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en metabole karakterisering van vetrijke dieet (HFD)-muizen gevoed als een veelgebruikte model van dieet-geïnduceerde insulineresistentie. We illustreren in detail de orale glucose tolerantie test (OGTT), die toezicht houdt op de perifere verwijdering van een oraal toegediende glucose laden en insuline secretie na verloop van tijd. Daarnaast presenteren we een protocol voor de insuline tolerantie test (ITT) om te controleren van gehele lichaam insuline actie. Samen vertegenwoordigen deze methoden en hun downstream toepassingen krachtige hulpmiddelen te karakteriseren de algemene metabole fenotype van muizen ook specifiek evalueren van wijzigingen in het glucose metabolisme. Zij kunnen vooral nuttig op het gebied van de brede onderzoek van insulineresistentie, diabetes en obesitas tot een beter inzicht in de pathogenese alsmede over het testen van de effecten van therapeutische interventies.
Introduction
In de ontwikkelde wereld bereikte obesitas en diabetes epidemische afmetingen als gevolg van fysieke inactiviteit en de excessieve consumptie van verwerkte voedingsmiddelen, effecten die worden gedreven door de snelle urbanisatie, industrialisering evenals globalisering. Hoewel onderzoek op insulineresistentie en het co-morbiditeit, zoals hyperlipidemie en atherosclerose, heeft bekendheid gekregen tijdens de laatste decennia, de complexe biologische mechanismen tot regeling van de stofwisseling bij gezondheid en ziekte nog onvolledig begrepen en er is nog steeds dringend behoefte aan nieuwe behandelmodaliteiten ter voorkoming en behandeling van deze ziekten1.
Insuline, en het counter-regulatory hormoon glucagon dienen als de belangrijkste regulatoren van cellulaire levering en macronutriënten energiebalans, dus ook de handhaving van goede systemische bloed glucose concentraties2. Glucose zelf fungeert als een van de belangrijkste stimulatoren van insuline secretie door de alvleesklier β-cellen, terwijl andere macronutriënten, de humorale factoren evenals de neurale inbreng verder deze reactie wijzigen. Insuline activeert de anabole processen van de fed staat bijgevolg door bevordering van de verspreiding van overtollige bloedglucose in spier- en vetcellen en verder glycolyse alsmede eiwit- of vetzuursynthese, respectievelijk te activeren. Bovendien onderdrukt de insuline hepatische glucose uitvoer door remming van de gluconeogenese. Chronische overtollige energieverbruik en meta-ontsteking leiden tot hyperinsulinemia en perifere insulineresistentie als gevolg van de down-regulatie van insuline receptor expressie, alsmede wijzigingen in de stroomafwaartse signaalroutes, aldus resulterend in verminderde gevoeligheid voor insuline-gemedieerde glucose verwijdering, alsmede onvoldoende remming van hepatische glucose productie3,4,5,6.
Een breed scala aan dierlijke modellen met genetische, voeding of experimentele inductie van ziekte hebben bewezen als uitstekende instrumenten te bestuderen van de moleculaire mechanismen van insulineresistentie en verschillende vormen van diabetes, alsmede de begeleidende ziekten7 . Een goed voorbeeld is de meest gebruikte en bekende HFD-geïnduceerde muismodel, dat wordt gekenmerkt door snelle gewichtstoename als gevolg van verhoogde inname in combinatie met verminderde metabole efficiëntie, resulterend in insuline resistentie8, 9. zowel in diermodellen en mensen, een hoogte in nuchtere bloed glucose en insuline niveaus, alsook een verminderde tolerantie-doorbraak tot glucose administratie zijn vaak gebruikte indicatoren van insulineresistentie en andere systemische wijzigingen van glucose metabolisme. Controle bloed glucose en insuline niveaus bij de basale stand of na stimulatie zijn daarom gemakkelijk toegankelijke uitlezingen.
Dit protocol beschrijft de generatie van muizen HFD-gevoed, alsmede twee veelgebruikte methoden, de orale glucose tolerantie test (OGTT) en de insuline resistentie test (ITT), die nuttig zijn te karakteriseren de metabole fenotype en te onderzoeken wijzigingen in het glucose metabolisme. We beschrijven de OGTT in detail dat de verwijdering van een oraal toegediende glucose laden en insuline secretie na verloop van tijd beoordeelt. Verder geven we instructies over de wijze van uitvoering van de ITT om te onderzoeken van gehele lichaam insuline-actie door controle van bloed glucose concentratie in reactie op een bolus insuline. De protocollen die in dit artikel beschreven zijn gevestigde en zijn gebruikt in meerdere studies10,–11,12. Wij bieden naast lichte wijzigingen die helpen kunnen om succes te verhogen, richtsnoeren voor de proefopzet en data-analyse, alsmede nuttige tips om te voorkomen dat potentiële valkuilen. De hierin beschreven protocollen kunnen zeer krachtige hulpmiddelen te onderzoeken van de invloed van genetische, farmacologische, voeding en andere omgevingsfactoren over hele lichaam glucose metabolisme en zijn geassocieerde aandoeningen zoals insulineresistentie. Naast stimulatie met glucose of insuline, kan een scala aan andere verbindingen worden gebruikt voor stimulatie afhankelijk van het doel van individuele onderzoek. Hoewel buiten het bereik van dit manuscript, kunnen vele andere downstream toepassingen worden uitgevoerd op de getekende bloedmonsters, zoals de analyse van bloedwaarden dan glucose en insuline (b.v., lipide en lipoproteïne profielen) evenals gedetailleerde analyse van metabole markers (bijvdoor kwantitatieve real-time Polymerase Chain Reaction (PCR), westelijke vlekkenanalyse en Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Verder stroom cytometry en fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden toegepast om te onderzoeken van de effecten in verschillende eencellige populaties, terwijl transcriptomic, proteomic en metabolomic benaderingen kunnen ook worden gebruikt voor irrelevante analyse.
Over het geheel genomen, bieden we een eenvoudig protocol voor het genereren van een HFD-geïnduceerde muismodel, terwijl verder beschrijven twee krachtige benaderingen om te bestuderen van gehele lichaam metabolische omzetting, de OGTT en de ITT, die nuttige hulpmiddelen worden kan voor het bestuderen van de pathogenese van de ziekte en het ontwikkelen van nieuwe therapieën, vooral op het gebied van metabolisme-geassocieerde ziekten zoals insulineresistentie en diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de hoge prevalentie van diabetes en geassocieerde ziekten in de wereldbevolking is er een sterke behoefte aan onderzoek aanpakken van het moleculaire mechanisme, preventie en behandeling van de ziekte19. Het gepresenteerde protocol gevestigde worden methoden beschreven voor de generatie van HFD muizen, een robuuste diermodel gebruikt voor metabole onderzoek, evenals de geleiding van de OGTT en de ITT, die krachtige hulpmiddelen voor de beoordeling van het gehele lichaam metabolische omzetting …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de medische wetenschappelijke Fonds van de burgemeester van de stad van Wenen en de Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
Referências
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
