חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)
Summary
המאמר הנוכחי מתאר את הדור ואת מטבולית איפיון של עכברים-fed דיאטה עתירת שומן כמודל של עמידות לאינסולין הנוצרות על-ידי תזונה והשמנה. עוד כולל פרוטוקולים מפורט לביצוע הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה ואת הבדיקה עמידות אינסולין, מעקב אחר שינויים לכל הגוף של גלוקוז חילוף החומרים ויוו.
Abstract
השמנת יתר מייצג את גורם הסיכון יחיד הכי חשוב בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, מחלה המתאפיינת התנגדות ספיגת הגלוקוז האינסולין, על ההחרפה ברוטו של מטבוליזם הגלוקוז מערכתית. למרות התקדמות ניכרת בהבנת מטבוליזם הגלוקוז, המנגנון המולקולרי של רגולציה שלה על בריאות ומחלה נשארים תחת-חקר, ואילו רומן גישות כדי למנוע ולטפל סוכרת נחוצים בדחיפות. דיאטה גלוקוז נגזר מעוררת הפרשת אינסולין, אשר משמש הרגולטור הראשי של התהליכים האנאבוליים הסלולר במהלך המדינה האכילו ובכך מאזן את רמת הסוכר בדם הלבלב רמות כדי לשמור על מצב האנרגיה מערכתית. האכלת מפעילים מטא-דלקת כרונית, מה שמוביל שינויים בהיקפי אינסולין. הקשורים קולטן איתות, ובכך מפחיתה את הרגישות וחיסול בתיווך אינסולין הגלוקוז. אירועים אלה בסופו של דבר לגרום גלוקוז בצום גבוהות, רמות האינסולין, כמו גם הפחתה גלוקוזה, אשר בתורו לשמש האינדיקטורים החשובים של תנגודת לאינסולין. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך את הדור מטבולית איפיון תזונה עתירת שומן (HFD)-נמאס עכברים כמודל בשימוש תכוף של דיאטה-induced תנגודת לאינסולין. אנו מדגימים בפירוט את המבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT), אשר עוקב אחר לרשות היקפיים של הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבדיקה עמידות אינסולין (ITT) לעקוב אחר פעילות לכל הגוף לאינסולין. יחד, שיטות אלה ושימושיהם במורד הזרם מייצגים כלים רבי-עוצמה כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולי כללי של עכברים גם לגבי במיוחד להעריך שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. הם עשויים להיות שימושית במיוחד בתחום מחקרית רחבה של תנגודת לאינסולין, סוכרת והשמנה לספק הבנה טובה יותר של פתוגנזה גם כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות טיפוליות.
Introduction
בעולם המפותח, השמנת יתר, סוכרת הגיעו ממדי מגפה עקב חוסר פעילות גופנית, צריכת עודף של מזון מעובד, תופעות אשר מונעים על ידי עיור מהיר, תיעוש, כמו גם הגלובליזציה. למרות מחקר על עמידות לאינסולין ועל זה morbidities משותף, כגון היפרליפידמיה, טרשת עורקים, צברה לגדולה במהלך העשורים האחרונים, המנגנונים הביולוגיים מורכבים אשר לווסת את חילוף החומרים על בריאות ומחלה נשארים שהיישום מובן עדיין קיים צורך דחוף הקדמה חדשה למנוע ולטפל במחלות אלה1.
אינסולין, גלוקגון הורמון counter-regulatory זה לשמש הרגולטורים העיקריים של האנרגיה התאית אספקת חומר מזין ואיזון, וכך גם שמירה על ריכוזי גלוקוז נאותה דם מערכתית2. גלוקוז עצמה פועלת כאחת תכשירים הראשי הפרשת האינסולין על ידי תאי β בלבלב, בעוד אחרים macronutrients, גורמים ההורמונאלית וכן לקלט העצבי עוד יותר לשנות תגובה זו. אינסולין וכתוצאה מכך מפעיל את התהליכים האנאבוליים של המדינה מוזן על ידי הקלת פעפוע של עודפי הסוכר לתוך שריר, תאי שומן נוסף מפעיל גליקוליזה וכן חלבון או חומצות סינתזה, בהתאמה. בנוסף, אינסולין הסתרת פלט גלוקוז בכבד על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה. צריכת אנרגיה עודף כרוני ודלקת meta להוביל hyperinsulinemia ו היקפית לאינסולין בשל למטה-ויסות לביטוי קולטן לאינסולין, כמו גם שינויים איתות המסלולים במורד הזרם, ובעקבותיה לקוי רגישות גלוקוז בתיווך האינסולין לרשותו וכן עיכוב לא מספיקות של גלוקוז בכבד ייצור3,4,5,6.
מגוון רחב של מודלים עם אינדוקציה גנטי, תזונתי או ניסיוני של מחלת הוכחו להיות כלי מצוין כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תנגודת לאינסולין ואת צורות שונות של סוכרת, כמו גם מחלות הנלוות שלה7 . דוגמה הוא הדגם בשימוש נרחב וותיקה HFD-induced העכבר, אשר מאופיין על ידי עלייה מהירה במשקל עקב תזונה מוגברת בשילוב עם מופחתת יעילות מטבולית, וכתוצאה מכך אינסולין התנגדות8, 9. הן בבעלי חיים ובבני אדם, ובחרמון צום גלוקוז, אינסולין ברמות בדם, כמו גם סובלנות לקוי גלוקוז למינהל הם אינדיקטורים בשימוש תכוף של תנגודת לאינסולין והשינויים מערכתית אחרים של גלוקוז חילוף החומרים. ניטור גלוקוז, אינסולין רמות בדם המדינה הבזליים או לאחר גירוי ולכן הם המפרט נגיש בקלות.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של עכברים HFD-fed, כמו גם שתי שיטות נפוצות, הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT) ואת הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT), אשר שימושיים כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולית וכדי לחקור שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. אנו מתארים את OGTT בפירוט, הבודק לרשות הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. יתר על כן, אנו מספקים ההוראות כיצד לנהל את ITT לחקור לכל הגוף לאינסולין-פעולה על-ידי ניטור ריכוז הגלוקוז בדם בתגובה סיילין של אינסולין. הפרוטוקולים המתוארות במאמר זה ומבוססת, נעשה שימוש במספר מחקרים10,11,12. בנוסף שינויים קלים אשר עשוי לסייע להגביר הצלחה, אנו מספקים הנחיות תכנון ניסויים, ניתוח נתונים, כמו גם עצות שימושיות להימנע ממלכודות הפוטנציאל. הפרוטוקולים המפורטים להלן יכולים להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים גנטי תרופתי, תזונתיים, אחרים על חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כל ועל הפרעות המשויכת שלו כמו תנגודת לאינסולין. בנוסף גירוי עם גלוקוז או אינסולין, מגוון רחב של תרכובות אחרות עשוי לשמש לגירוי בהתאם למטרת מחקר אישיים. למרות מחוץ הטווח של כתב יד זה, יישומים רבים אחרים במורד הזרם ניתן לבצע את דגימות הדם נמשך, כגון הניתוח של דם ערכים שאינם גלוקוז, אינסולין (למשל, שומנים בדם, כולסטרול # ליפופרוטאינים פרופילי) כמו גם נתונים היסטוריים ניתוח של סמנים מטבוליים (למשל, על ידי בזמן אמת כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (PCR), ניתוח תספיג Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה)). בהמשך flow cytometry, קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) ניתן להחיל לחקור את ההשפעות אוכלוסיות נפרדות תא בודד, בעוד transcriptomic פרוטיאומיה מבנית, גישות metabolomic עשוי גם להיות מנוצל עבור ניתוח untargeted.
בסך הכל, אנו מספקים פרוטוקול פשוט כדי ליצור מודל HFD-induced העכבר, בעוד נוסף המתאר שתי גישות עוצמה ללמוד שינויים מטבוליים לכל הגוף, את OGTT, ITT, אשר יכול להיות כלים שימושיים ללימוד בפתוגנזה של המחלה, פיתוח טיפולים חדשים, בעיקר בתחום של חילוף החומרים-הקשורים למחלות כמו תנגודת לאינסולין & סוכרת.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם שכיחות גבוהה של סוכרת ומחלות המשויך באוכלוסיית העולם, יש דרישה חזקה למחקר פונה את המנגנון המולקולרי, מניעה וטיפול של מחלות19. פרוטוקול הציג מתאר שיטות ומבוססת על הדור של עכברים HFD, מודל בעלי חיים חזקים בשימוש עבור מחקר מטבולית, כמו גם את הולכה של OGTT, ITT, אשר הם כלי חזק ההערכה של…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן מדעי רפואי של ראש העיר של העיר וינה, את und Laboratoriumsmedizin לדנציג Österreichische בווריה Chemie פסיכולוג קליני.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
Referências
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
