Studie av i Vivo glukose metabolisme i fettrikt kosthold-matet mus muntlig glukose toleranse Test (OGTT) og Insulin toleranse Test (ITT)

Summary

Gjeldende artikkelen beskriver generasjon og metabolske karakteristikk av fettrikt kosthold-matet mus som en modell av diett-indusert insulinresistens og fedme. Det har videre detaljerte protokoller for å utføre oral glukose toleranse test og insulin toleranse test, overvåking hele kroppen endringer av glukose metabolisme i vivo.

Abstract

Fedme representerer den viktigste risiko faktoren i patogenesen av type 2 diabetes, en sykdom som er preget av en motstand mot insulin-stimulert glukose opptak og en brutto decompensation av systemisk glukose metabolisme. Til tross for betydelig fremgang i forståelsen av glukose metabolisme fortsatt molekylære mekanismer av sin regulering i helse og sykdom under-undersøkt, mens romanen tilnærminger for å forebygge og behandle diabetes er presserende nødvendig. Kosthold avledede glukose stimulerer bukspyttkjertelen sekresjon av insulin, som fungerer som den viktigste regulatoren av mobilnettet anabole prosesser under matet-staten og dermed balanserer blodsukker nivåer for å opprettholde systemisk energi status. Kronisk overfeeding utløsere meta-betennelse, noe som fører til endringer i eksterne insulin receptor-assosiert signalisering og dermed reduserer følsomhet for insulin-mediert glukose disposisjon. Disse hendelsene til slutt føre til forhøyet fastende glukose og insulin nivåer samt en reduksjon i glukosetoleranse, som i sin tur fungerer som viktige indikatorer for insulinresistens. Her presenterer vi en protokoll for generasjon og metabolske karakteristikk av fettrikt kosthold (HFD)-matet mus som brukte modell av diett-indusert insulinresistens. Vi illustrere i detalj muntlig glukose toleranse test (OGTT), som overvåker ekstern avhending av en muntlig-administrert glukose belastning og insulin sekresjon over tid. I tillegg presenterer vi en protokoll for insulin toleranse test (ITT) for å overvåke hele kroppen insulin handling. Sammen representerer disse metodene og nedstrøms programmene kraftige verktøy som karakteriserer de generelle metabolske fenotypen av mus samt som spesielt vurdere endringer i glukose metabolisme. De kan være spesielt nyttig i feltet bred forskning av insulinresistens, diabetes og fedme å gi en bedre forståelse av patogenesen samt teste effekten av terapeutisk intervensjon.

Introduction

I den utviklede verden nådd fedme og diabetes epidemiske dimensjoner fysisk inaktivitet og overflødig forbruket av bearbeidet mat, effekter som er drevet av rask urbanisering, industrialisering samt globalisering. Selv om forskning på insulinresistens og det Co-morbidities, som hyperlipidemi og åreforkalkning, fått publisitet i løpet av de siste tiårene, de komplekse biologiske mekanismene som regulerer stoffskiftet i helse og sykdom fortsatt ufullstendig forstått og det er fortsatt et presserende behov for nye behandlingsmetoder å forebygge og behandle disse sykdommer¹.

Insulin, og det er counter-regulatory hormon glukagon tjene som viktigste regulatorer av celleenergien tilbud og macronutrient balanse, dermed også opprettholde riktig systemisk blod glukose konsentrasjoner². Glukose selv fungerer som en av de viktigste stimulators på insulinsekresjon av bukspyttkjertelen β-celler, mens andre makronæringsstoffer, Humorale faktorer samt nevrale inn ytterligere endre dette svaret. Insulin utløser følgelig anabole prosessene av matet av lette spredningen av overskytende blod glukose i muskler og fett celler og ytterligere aktivere Glykolysen samt protein- eller fettsyrer syntese, henholdsvis. I tillegg undertrykker insulin hepatic glukose utdata ved å hemme Glukoneogenesen. Kronisk overflødig energiforbruk og meta-betennelse føre til hyperinsulinemia og eksterne insulinresistens på grunn av ned-reguleringen av insulin reseptor uttrykk, samt endringer i nedstrøms signalveier, dermed resulterer i svekket følsomhet for insulin-mediert glukose disposisjon samt utilstrekkelig hemming av hepatic glukose, produksjon,^3,,^4,,^5,,⁶.

En rekke dyr modeller med genetisk, ernæringsmessige eller eksperimentelle induksjon av sykdommen har vist seg for å være utmerket verktøy for å studere molekylære mekanismer av insulinresistens og ulike former for diabetes samt de tilhørende sykdommer⁷ . Et godt eksempel er mye brukt og godt etablert HFD-indusert musen modellen, som er preget av rask vektøkning på grunn av økt inntak i kombinasjon med redusert metabolsk effektivitet, noe som resulterer i insulin resistens^{8, 9}. både i dyremodeller og mennesker, en høyde i faste blod glukose og insulin nivåer, samt en nedsatt toleranse til glukose administrasjon er brukte indikatorer på insulinresistens og andre systemisk endringer av glukose metabolisme. Overvåking blod glukose og insulin nivåer på basale staten eller etter stimulering er derfor lett tilgjengelig readouts.

Nåværende protokollen skisserer generering av HFD-matet mus samt to brukte metoder, muntlig glukose toleranse test (OGTT) og insulin resistens test (ITT), som er nyttig å karakterisere metabolske fenotypen og undersøke endringer i glukose metabolisme. Vi beskriver OGTT i detalj, som vurderer salg av en muntlig-administrert glukose belastning og insulin sekresjon over tid. Videre, vi gir instruksjoner om hvordan å gjennomføre ITT for å undersøke hele kroppen insulin handling ved å overvåke blod glukose konsentrasjon svar på bolus av insulin. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen er godt etablert og har blitt brukt i flere studier^10,11,12. I tillegg til små endringer som kan bidra til å øke suksess, gir vi retningslinjer for eksperimentell design og analyse, samt nyttige tips å unngå potensielle feller. Protokollene beskrevet her kan være svært kraftig verktøy for å undersøke påvirkning av genetiske, farmakologiske, kosttilskudd og andre miljømessige faktorer på hele kroppen glukose metabolisme og dens tilknyttede lidelser som insulinresistens. I tillegg til stimulering med glukose eller insulinresistens, kan en rekke andre forbindelser brukes til stimulering avhengig av formålet med personlige forskning. Selv om du er utenfor omfanget av dette manuskriptet, kan mange andre nedstrøms programmer utføres på trukket blodprøvene, som analyse av blod verdier enn glukose og insulin (f.eks, lipid og lipoprotein profiler) og detaljert analyse av metabolske markører (f.ekskvantitative sanntid Polymerase kjedereaksjon (PCR), Western blot analyse og Enzyme-Linked Immunosorbent analysen (ELISA)). Videre flow cytometri og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) brukes til å undersøke effektene i forskjellige enkelt celle populasjoner, mens transcriptomic, proteomic og metabolomic tilnærminger kan også benyttes for uønskede analyse.

Total, vi gir en enkel protokoll for å generere en HFD-indusert musemodell, mens ytterligere beskriver to kraftige tilnærminger for å studere hele kroppen metabolske forandringer, OGTT og ITT, som kan være nyttige verktøy for å studere sykdom patogenesen og utvikle nye terapier, spesielt innen stoffskifte-assosiert sykdommer som insulinresistens og diabetes.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk komité medisinsk Universität Wien og gjennomført i henhold til Federation av europeiske laboratorium dyr Science foreninger (FELASA). Vær oppmerksom på at alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen skal bare utføres etter institusjonelle og offentlige godkjenning og ansatte som er teknisk dyktig. 1. HFD-matet mus Merk: Opprettholde alle C57BL/6J mus på en 12-h lys/mørke syklus me…

Representative Results

Figur 1 illustrerer en skjematisk tidsskjemaet for metabolske phenotyping mus på dietter. I en alder av ca. 6 uker plasseres mus på en HFD, mens en Hanne Cathrine-gruppe kan tjene som kontrollgruppen. Viktigere, bør kroppsvekt fastsettes ukentlig å observere hvis det er en forventet økning i kroppsvekt. Noen slags stress (f.eks, støy eller aggressiv mannlige atferd) kan forstyrre vektøkning og bør fjernes umiddelbart. Hver kohort mus for diet…

Discussion

Med den høye utbredelsen av diabetes og tilknyttede sykdommer i verdens befolkning er det et sterkt behov for forskning molekylære mekanisme, forebygging og behandling av sykdom¹⁹. Presentert protokollen beskriver veletablerte metoder for generering av HFD mus, en robust dyr modell som brukes for metabolske forskning, samt gjennomføring av OGTT og ITT, som er potent verktøy for vurdering av hele kroppen metabolske forandringer som insulinresistens. Metodene i denne artikkelen kan være nyttig …

Materials

Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa – Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa – Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid – Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline – creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT