Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)
Summary
El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.
Abstract
La obesidad representa el más importante factor de riesgo en la patogenia de la diabetes tipo 2, una enfermedad que se caracteriza por una resistencia a la captación de glucosa estimulada por insulina y una descompensación grave del metabolismo de la glucosa sistémica. A pesar de progresos considerables en la comprensión del metabolismo de la glucosa, los mecanismos moleculares de la regulación en salud y la enfermedad siguen bajo investigación, mientras que se necesitan urgentemente nuevos enfoques para prevenir y tratar la diabetes. Dieta derivada de la glucosa estimula la secreción pancreática de insulina, que sirve como el principal regulador de los procesos anabólicos celulares durante el estado de alimentación y así equilibra la glucosa en la sangre los niveles para mantener la condición de energía sistémica. Sobrealimentación disparadores meta-inflamación crónica, que conduce a alteraciones en la insulina periférica asociado a receptor de señalización y por lo tanto reduce la sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina. Estos eventos resultan en elevados de glucosa en ayunas y los niveles de insulina así como una reducción en la tolerancia a la glucosa, que a su vez sirven como indicadores importantes de resistencia a la insulina. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y caracterización metabólica de la dieta alta en grasas (HFD)-alimentó ratones como modelo frecuente de resistencia a la insulina inducida por la dieta. Ilustramos detalladamente la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), que supervisa la disposición periférica de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, presentamos un protocolo para la prueba de tolerancia a insulina (ITT) supervisar la acción de la insulina de todo el cuerpo. Estos métodos y sus aplicaciones posteriores constituyen herramientas poderosas para caracterizar el fenotipo metabólico general de ratones, así como para evaluar específicamente alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Pueden ser especialmente útiles en el campo de investigación amplio de resistencia a la insulina, diabetes y obesidad para proporcionar una mejor comprensión de la patogenia, así como para probar los efectos de las intervenciones terapéuticas.
Introduction
En los países desarrollados, la obesidad y la diabetes alcanzaron dimensiones epidémicas debido a la inactividad física y el consumo excesivo de alimentos procesados, efectos que son conducidos por la rápida urbanización, industrialización y globalización. Aunque investigación en resistencia a la insulina y sus comorbilidades, tales como hiperlipidemia y aterosclerosis, ha ganado importancia en las últimas décadas, los complejos mecanismos biológicos que regulan el metabolismo en la salud y la enfermedad siguen siendo incompleto entendido y todavía hay una necesidad urgente de nuevas modalidades de tratamiento prevenir y tratar estas enfermedades1.
Insulina y sus hormonas contador-reguladoras glucagón sirven como los principales reguladores del equilibrio oferta y macronutrientes energía celular, manteniendo así también sangre sistémica adecuada glucosa concentraciones2. Glucosa sí mismo actúa como uno de los principales estimuladores de la secreción de insulina por células β pancreáticas, mientras que otros macronutrientes, factores humorales como entrada neural más modificar esta respuesta. Insulina, en consecuencia, desencadena los procesos anabólicos del estado fed facilitando la difusión de glucosa en la sangre de exceso en la músculo y células gordas y además activando la glucólisis así como proteínas o síntesis de ácidos grasos, respectivamente. Además, insulina suprime la salida de glucosa hepática inhibiendo la gluconeogénesis. Consumo de energía de exceso crónico y meta-inflamación conducen a hiperinsulinemia y resistencia a la insulina periférica debido a la abajo-regulación de la expresión del receptor de insulina, así como alteraciones en las vías de señalización aguas abajo, lo que resulta en deterioro sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina, así como inhibición insuficiente de la glucosa hepática producción3,4,5,6.
Una amplia gama de modelos animales con inducción genética, nutricional o experimental de la enfermedad han demostrado para ser excelentes herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a la insulina y varias formas de diabetes, así como sus enfermedades acompañantes7 . Un ejemplo es el modelo de ratón inducido por HFD ampliamente utilizado y bien establecida, que se caracteriza por el rápido aumento de peso debido al aumento de la ingesta dietético en combinación con la menor eficiencia metabólica, resultando en resistencia de insulina8, 9. tanto en modelos animales y humanos, una elevación en sangre glucosa y la insulina niveles en ayunas, así como una tolerancia deteriorada a la administración de glucosa son utilizados indicadores de resistencia a la insulina y otras alteraciones sistémicas de la glucosa metabolismo. Monitoreo glucosa e insulina niveles de sangre en el estado basal o tras estímulo son lecturas de fácil acceso.
El presente Protocolo describe la generación de ratones alimentados con HFD como dos métodos utilizados, la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de resistencia de insulina (ITT), que son útiles para caracterizar el fenotipo metabólico e investigar alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Describimos la OGTT detalladamente, que evalúa la eliminación de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, ofrecemos instrucciones sobre cómo llevar a cabo la ITT para investigar la acción de la insulina corporal total mediante el control de la concentración de la glucosa de la sangre en respuesta a un bolo de insulina. Los protocolos descritos en este artículo están bien establecidos y se han utilizado en múltiples estudios10,11,12. Además de ligeras modificaciones que pueden ayudar a incrementar el éxito, les da las pautas para el diseño experimental y análisis de datos, así como consejos útiles evitar peligros potenciales. Los protocolos descritos pueden ser herramientas muy poderosas para investigar la influencia de la genéticas, farmacológicos, dieta y otros factores ambientales sobre el metabolismo de la glucosa de todo el cuerpo y sus enfermedades asociadas como resistencia a la insulina. Además de la estimulación con glucosa o insulina, puede utilizarse una variedad de otros compuestos para la estimulación según el propósito de la investigación individual. Aunque fuera del alcance de este manuscrito, muchas otras aplicaciones posteriores pueden realizarse en las muestras de sangre dibujada, como el análisis de sangre valores distintos de la glucosa y la insulina (p. ej., lípidos y lipoproteínas perfiles) así como toda Análisis de marcadores metabólicos (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, análisis de Western blot y análisis genitals del Immunosorbent (ELISA)). Citometría de flujo más y fluorescencia activada célula clasificación (FACS) puede aplicarse para investigar los efectos en las poblaciones de la célula distinta, mientras que transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos enfoques también pueden ser utilizados para el análisis no focalizados.
En general, proporcionamos un protocolo simple para generar un modelo de ratón inducido por HFD, mientras más describir dos enfoques de gran alcance para estudiar alteraciones metabólicas de todo el cuerpo, la usa y la ITT, que puede ser herramientas útiles para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias, especialmente en el campo de enfermedades asociadas por el metabolismo como la resistencia a la insulina y diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la alta prevalencia de diabetes y enfermedades asociadas en la población mundial, hay una necesidad para la investigación abordando el mecanismo molecular, prevención y tratamiento de la enfermedad19. El protocolo presentado describe métodos bien establecidos para la generación de ratones HFD, un robusto modelo animal utilizado para la investigación metabólica, así como la conducción de la OGTT y ITT, que son potentes herramientas para la evaluación de las alteraciones metabólicas d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el fondo científico médico del alcalde de la ciudad de Viena y la Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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