Studie av In Vivo glukosmetabolismen i fettrik kost-matade möss använder Oral glukostoleranstest (OGTT) och Insulin tolerans Test (ITT)
Summary
Den nuvarande artikeln beskriver generation och metabola karakterisering av fettrik kost-matade möss som en modell av kost-inducerad insulinresistens och fetma. Här finns ytterligare detaljerade protokoll för att utföra den oralt glukostoleranstest och insulin tolerans test, övervakning av glukos metabolism i vivoförändringar på hela kroppen.
Abstract
Fetma representerar den viktigaste enda riskfaktorn i patogenesen vid typ 2-diabetes, en sjukdom som kännetecknas av ett motstånd mot insulin-stimulerat glukosupptag och en grov dekompensation av systemisk glukosmetabolism. Trots betydande framsteg i förståelsen av glukosmetabolism fortfarande molekylära mekanismer för dess reglering vid hälsa och sjukdom under-undersökt, medan nya metoder att förebygga och behandla diabetes behövs omgående. Kost härledda glukos stimulerar bukspottskörteln utsöndringen av insulin, som fungerar som den huvudsakliga regulatorn av cellulära anabola processer under fed-tillståndet och därmed balanserar blodsocker nivåer för att behålla systemisk energistatus. Kronisk övergödning utlösare meta-inflammation, vilket leder till förändringar i perifer insulin receptor-associerade signalering och minskar känsligheten för insulin-medierad glukos förfogande. Dessa händelser i slutändan leda till förhöjt fasteglukos och insulinnivåer samt en minskning i glukostolerans, som i sin tur fungera som viktiga indikatorer för insulinresistens. Här presenterar vi ett protokoll för generering och metabola karakterisering av fettrik kost (HFD)-matade möss som används ofta modell för kost-inducerad insulinresistens. Vi visar i detalj den oralt glukostoleranstest (OGTT), som övervakar perifera avyttring av ett oralt glukos belastning och insulin sekretionen över tid. Dessutom presenterar vi ett protokoll för insulin tolerans test (ITT) att övervaka hela kroppen insulinkänsligheten åtgärd. Tillsammans, utgör dessa metoder och deras nedströms tillämpningar kraftfulla verktyg att karakterisera den allmänna metabola fenotypen av möss samt att särskilt bedöma förändringar i glukosmetabolismen. De kan vara särskilt användbart i fältet bred forskning av insulinresistens, diabetes och fetma att få en bättre förståelse för patogenes samt att testa effekterna av terapeutiska interventioner.
Introduction
I den utvecklade världen nått fetma och diabetes epidemiska dimensioner på grund av fysisk inaktivitet och överkonsumtion av bearbetade livsmedel, effekter som drivs av snabba urbaniseringen, industrialiseringen, samt globalisering. Även om forskning på insulinresistens och det är komorbiditeter, såsom hyperlipidemi och åderförkalkning, har fått framträdande under de senaste decennierna, de komplexa biologiska mekanismer som reglerar ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom förbli ofullständigt förstod och det finns fortfarande ett akut behov av nya behandlingsformer att förebygga och behandla dessa sjukdomar1.
Insulin och det är motverkande hormonet glukagon fungera som de huvudsakliga regulatorerna av cellulär energi försörjning och macronutrient balans, därmed också upprätthålla korrekt systemisk blod glukos koncentrationer2. Glukos själv fungerar som en av de viktigaste stimulatorer av insulinsekretionen genom bukspottkörtelns β-celler, medan andra makronäringsämnen, humorala faktorer liksom neurala input ytterligare ändra detta svar. Insulin utlöser följaktligen ätit anabola processer genom att underlätta diffusion av överflödigt blodglukos i muskel- och fettceller och ytterligare aktiverar glykolys samt protein- eller fettsyra syntesen, respektive. Dessutom dämpar insulin nedsatt glukos utdata genom att hämma glukoneogenesen. Kroniskt överskott av energi och meta-inflammation leda till Hyperandrogenism och perifer insulinresistens på grund av ned-regleringen av insulin receptoruttryck samt förändringar i nedströms signalvägar, vilket resulterar i nedsatt känslighet för insulin-medierad glukos förfogande samt otillräcklig hämning av nedsatt glukos produktion3,4,5,6.
Ett brett utbud av djurmodeller med genetiska, näringsmässiga eller experimentella induktion av sjukdom har visat sig vara utmärkta verktyg för att studera molekylära mekanismer för insulinresistens och olika former av diabetes liksom dess åtföljande sjukdomar7 . Ett paradexempel är utbredda och väletablerad HFD-inducerad musmodell, som kännetecknas av snabb viktuppgång på grund av ökade intaget i kombination med nedsatt metabolisk effektivitet, vilket resulterar i insulin resistens8, 9. både i djurmodeller och människor, en höjning i fastande glukos och insulin i blodet, samt en försämrad tolerans till glukos administration är vanliga indikatorer av insulinresistens och andra systemiska förändringar av glukos ämnesomsättningen. Övervakning glukos och insulin i blodet vid basal staten eller efter stimulering är därför lättillgängligt utläsningar.
Protokolls beskriver generationen av HFD-matade möss samt två vanliga metoder, den oralt glukostoleranstest (OGTT) och insulin resistens testet (ITT), som är användbara att karakterisera den metabola fenotypen och utreda förändringar i glukosmetabolismen. Vi beskriver OGTT i detalj, som utvärderar avyttring av ett oralt glukos belastning och insulin sekretionen över tid. Vidare, vi ge instruktioner om hur man genomför ITT för att undersöka hela kroppen insulin-action genom att övervaka blodglukoskoncentration som svar på en bolusdos av insulin. De protokoll som beskrivs i denna artikel är väletablerad och har använts i flera studier10,11,12. Vi lämnar förutom smärre ändringar som kan bidra till att öka framgång, riktlinjer för experimentell design och analys av data, samt användbara tips att undvika potentiella fallgropar. De protokoll som beskrivs häri kan vara mycket kraftfulla verktyg för att undersöka påverkan av genetiska, farmakologisk, kost och andra miljöfaktorer på hela kroppen glukosmetabolism och dess associerade sjukdomar såsom insulinresistens. Förutom stimulering med glukos eller insulin, kan en mängd andra föreningar användas för stimulering beroende på syftet med enskilda forskning. Även om utanför tillämpningsområdet för detta manuskript, kan många andra nedströms tillämpningar utföras på de dragna blodproverna, såsom analys av blodvärden än glukos och insulin (t.ex., lipider och lipoprotein profiler) samt detaljerade analys av metabola markörer (t.ex., av kvantitativa realtid Polymerase Chain Reaction (PCR), Western blot analys och enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA)). Ytterligare flödescytometri och fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) kan användas för att undersöka effekterna i distinkta enda cellpopulationer, medan transcriptomic, proteomiska och metabolomiska metoder kan också användas för oriktade analys.
Sammantaget erbjuder vi ett enkelt protokoll för att generera en HFD-inducerad musmodell, samtidigt som ytterligare beskriver två kraftfulla metoder för att studera hela kroppen metabola förändringar, OGTT och ITT, som kan vara användbara verktyg för att studera sjukdomspatogenes och utveckla nya behandlingar, särskilt i området metabolism-associerade sjukdomar såsom insulinresistens och diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den höga prevalensen av diabetes och associerade sjukdomar hos världens befolkning finns det ett starkt krav för forskning behandlar molekylär mekanism, förebyggande och behandling av sjukdom19. Presenterade protokollet beskriver väl inarbetade metoder för generering av HFD möss, en robust djurmodell som används för metabolisk forskning, liksom överledning av OGTT och ITT, som är potent verktyg för bedömning av hela kroppen metabola förändringar såsom insulinresistens. De meto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av medicinska vetenskapliga fonden av borgmästare av staden Wien och Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
Referências
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
