Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero
Summary
Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.
Abstract
Autónoma-célula neuronais funções dos genes podem ser reveladas, causando perda ou ganham de função de um gene em uma população pequena e esparsa de neurônios. Para fazer isso requer gerando um mosaico em que neurônios com perda ou ganho de função de um gene são rodeados por tecido geneticamente imperturbável. Aqui, nós combinamos o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar tecido de cérebro de mosaico que pode ser usado para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. DNA construções (disponível através de repositórios), que codifica para uma etiqueta fluorescente e Cre recombinase, são introduzidos em desenvolver os neurônios corticais que contém genes ladeados com loxP sites nos cérebros de embriões de rato usando utero em eletroporação. Além disso, descrevemos várias adaptações para o método de eletroporação no utero que aumentam a capacidade de sobrevivência e reprodução. Esse método também envolve o estabelecimento de um título para recombinação mediada por Cre em uma população esparsa ou densa de neurônios. Preparações histológicas do tecido cerebral rotulado não exigem (mas pode ser adaptadas para) imuno-histoquímica. As construções utilizadas garantem que fluorescente etiquetado neurônios carreg o gene recombinase Cre. Preparações histológicas permitem a análise morfológica dos neurônios através da imagem latente confocal de mandris dendríticas e axonal e espinhas dendríticas. Porque a perda ou ganho de função pode é feito de tecido mosaico esparsas, esse método permite que o estudo da célula autónomos necessidade e suficiência do gene produtos na vivo.
Introduction
Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.
Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal1, mosaicismo feminino ligado ao X2,3,4, e mosaicismo somático endógena5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção (“floxed”). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP7. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células (“linha de repórter de Cre”). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos8. Linhas de repórter CRE podem expressar CreERT2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)9. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese12 ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado13 ou lentivírus14 carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.
Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente22. Outra estratégia é usar o sistema de “Supernova”, projetado especificamente com esses parâmetros em mente23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos a combinação de eletroporação no utero com Cre recombinase em camundongos floxed para gerar o tecido cerebral de mosaico. Uma vantagem dessa abordagem é que uma nova linha de rato não precisa ser gerado cada vez um diferente subtipo de celular está a ser alvo: eletroporação no utero pode ser usada para direcionar os neurônios excitatórios, neurônios inibitórios ou glia dependendo do tempo e localização do electroporation15,<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças ao apoio generoso da James Madison University departamento de biologia e da facilidade de Imaging e James Madison University microscopia de luz. Dr. Mark L. Gabriele para conselhos úteis sobre preparação de jovens pós-natal tecido, e DRS Justin W. Brown e Corey L. Cleland para coordenação generoso de espaço e materiais cirúrgicos. Esta pesquisa foi financiada em parte por uma concessão de pesquisa colaborativa por 4-VA, uma parceria de colaboração para fazer avançar a Commonwealth da Virgínia (G.S.V.) e por uma Virginia Academia de ciência pequeno projeto bolsa de investigação (G.S.V.). Suporte foi generosamente fornecido por uma doação de Betty Jo amoroso Butler 58 para bolsa de pesquisa de graduação (para K.M.B.), uma bolsa de pesquisa do verão de Farrell (para K.M.B.), um James Madison University segundo século Scholarship (para K.M.B.), um James Universidade de Madison do centenário uma bolsa (C.J.H.), uma Universidade de James Madison Lucy Robinson busca 30 bolsa de Memorial (para Z.L.H.) e um James Madison Universidade faculdade de Ciências e matemática da faculdade assistência Grant (para G.S.V.).
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
Referências
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