Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero
Summary
Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.
Abstract
Cella-autonome funzioni neuronali dei geni possono essere rivelate causando perdita o guadagno di funzione di un gene in una popolazione di piccola e sparsa di neuroni. Per effettuare questa operazione richiede la generazione di un mosaico in cui i neuroni con perdita o guadagno di funzione di un gene sono circondati da tessuto geneticamente imperturbato. Qui, uniamo il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell’utero al fine di generare tessuto cerebrale mosaico che può essere utilizzato per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Costrutti del DNA (disponibili nei repository), che codifica per un’etichetta fluorescente e la Cre ricombinasi, vengono introdotti nello sviluppo di neuroni corticali contenenti geni affiancati con siti loxP nei cervelli degli embrioni del mouse utilizzando in utero elettroporazione. Inoltre, descriviamo vari adattamenti per il metodo di elettroporazione nell’utero che aumentano la sopravvivenza e la riproducibilità. Questo metodo coinvolge anche stabilire un titolo per ricombinazione Cre-mediata in una rada o densa popolazione di neuroni. Preparati istologici del tessuto cerebrale con etichetta non richiedono (ma può essere adattati a) immunohistochemistry. I costrutti utilizzati garantiscono che fluorescente etichettati neuroni trasportare il gene per la ricombinasi Cre. Preparati istologici consentono analisi morfologica dei neuroni confocale imaging delle pergole dentritici ed axonal e spine dendritiche. Perché perdita o guadagno di funzione è realizzato in tessuto di tipo sparse mosaico, questo metodo consente lo studio delle necessità delle cellule autonome e la sufficienza della gene prodotti in vivo.
Introduction
Generando un mosaico genetico è un classico paradigma sperimentale per comprendere la funzione di un gene di interesse. Per determinare se un gene è necessario per un fenotipo cellulare, l’approccio più semplice è causando una perdita di funzione del gene in tutto l’organismo (ad es. ad eliminazione diretta). Tuttavia, per determinare se un gene è necessaria in particolare in un determinato tipo di cellula, knockout del gene in tutto l’organismo non è un approccio valido. Al contrario, è necessario un metodo che causerà la perdita di funzione di un gene in una determinata cella mentre è circondato da tessuto wildtype (cioè geneticamente imperturbata) — in altre parole, creare mosaico tessuto. Se la cellula mutante Mostra un fenotipo mutante, ma non di cellule wildtype circostanti, le funzioni del gene in maniera autonoma delle cellule. L’analisi del tessuto del mosaico, in cui le cellule mutanti sono circondate da tessuto wildtype, è ideale per la comprensione delle cellule autonome funzioni dei geni, in particolare nel cervello dove i neuroni e cellule gliali formano una vasta rete interconnessa di tessuto.
Diverse forme di tessuto cerebrale mosaico hanno fornito modelli potenti per indagare le funzioni delle cellule-autonoma di geni. Studi incentrati su trapianto neuronale1, mosaicismo femminile legato al X2,3,4, ed endogeno mosaicism somatico5,6 hanno attirato loro conclusioni basate su mosaico tessuto cerebrale. Eliminazione condizionale di un gene attraverso il sistema di ricombinazione di Cre-lox è un metodo che sfrutta al meglio la grande disponibilità di linee di topi transgenici. In questo metodo, vengono introdotti due siti loxP su entrambi i lati di una necessaria sequenza di un gene (ad esempio di un esone), lasciandola affiancato da siti loxP che entrambi si affacciano nella stessa direzione (“floxed”). Cre ricombinasi accise la sequenza tra i siti loxP7. Ricombinazione cre-mediata può essere ottenuta da incrocio floxed topi a un’altra linea di mouse che esprimono Cre ricombinasi insieme con un marcatore fluorescente in un sottogruppo di cellule (“Cre reporter linea”). Questo è stato dimostrato in una varietà di modi per scoprire le funzioni di un gene in sottoinsiemi di cellule, quali i neuroni eccitatori o astrociti8. Linee di cre reporter possono esprimere CreERT2 per consentire la ricombinazione Cre-mediata di essere farmaco-inducibile (singoli neuroni etichettatura con knockout inducibile Cre-mediata, o SLICK)9. Un’altra strategia chiamato analisi di mosaico con doppio marker (MADM)10,11, ricombinazione di interchromosomal Cre-mediata consente un omozigote mutante deve essere creato a fianco del tessuto eterozigotico. In questi approcci, una nuova linea di topi deve essere prodotta ogni volta per ogni gene candidato o sottotipo cellulare che viene testato. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere introdotto dopo la nascita tramite ionoforesi12 o tramite vettori virali (ad es. virus adeno-associato13 o lentivirus14 trasporto cellulari sottotipo-specifici promotori). Questa strategia crea etichettatura forte e postnatale. Per indirizzare lo sviluppo di neuroni corticali cerebrali scarsamente e prenatally, una strategia ideale è nell’utero elettroporazione di Cre ricombinasi con un marcatore fluorescente.
Oltre alla ricombinazione di Cre-lox attraverso elettroporazione nell’utero per produrre la combinazione del mosaico del tessuto in vivo, vi presentiamo diversi adattamenti alle procedure da altri protocolli pubblicati15,16, 17,18,19,20,21. Forniamo informazioni per migliorare il successo nel tempo-incinta femmine riproduttrici. Descriviamo anche i nostri due strategie per introdurre l’etichettatura dei neuroni nel tessuto corticale sparse e brillante: una strategia consiste nel titolo i livelli di un singolo costrutto che codifica per la Cre ricombinasi e un marcatore fluorescente22. Un’altra strategia consiste nell’utilizzare il sistema di “Supernova”, progettato specificamente per questi parametri in mente23,24. Inoltre, offriamo miglioramenti sulla produzione coerente microiniezione pipette e semplificazioni per la chirurgia di elettroporazione nell’utero . Infine, abbiamo delineare fasi critiche in una preparazione istologica semplificata che consente l’analisi delle spine dendritiche e pergole dentritici ed axonal, senza ulteriore colorazione o immunohistochemistry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo la combinazione dell’elettroporazione in utero con Cre ricombinasi nei topi floxed per generare tessuto cerebrale mosaico. Un vantaggio di questo approccio è che una nuova linea di mouse non ha bisogno di essere generata ogni volta un diverso sottotipo cellulare deve essere mirata: elettroporazione in utero può essere utilizzato per indirizzare i neuroni eccitatori, neuroni inibitori o glia a seconda del periodo e la posizione di elettroporazione15,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il generoso sostegno della James Madison University Dipartimento di biologia e la microscopia luce James Madison University e Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele per consigli utili per quanto riguarda la preparazione di tessuti postnatale giovane, e d. ssa Justin W. Brown e Corey L. Cleland per generoso coordinamento dei materiali chirurgici e spazio. Questa ricerca è stata finanziata in parte da una sovvenzione di ricerca collaborativa da 4-VA, una partnership di collaborazione per far progredire il Commonwealth della Virginia (G.S.V.) e da un Virginia Accademia di scienza piccolo progetto Research Grant (G.S.V.). Supporto è stato generosamente fornito da una dotazione di Betty Jo amorevole Butler 58 per borsa di ricerca dello studente non laureato (a K.M.B.), una borsa di ricerca di estate di Farrell (a K.M.B.), un James Madison University secondo secolo Scholarship (a K.M.B.), un James Madison University Centennial borsa di studio (C.J.H.), una James Madison University Lucy Robinson cerca 30 Memorial Scholarship (a Z.L.H.) e a James Madison University College di Scienze e matematica facoltà assistenza Grant (a G.S.V.).
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
Referências
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