乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築
1Division of Pathology,Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine,University of Milan, 3School of Biology,University of Pavia, 4Division of Breast Surgery,Fondazione IRCCS Ca’ Granda – Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology,Fondazione IRCCS Ca’ Granda – Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences,University of Milan
Summary
HER2 陽性細胞の不均質分布は、乳癌のサブセットに観察することができ、臨床のジレンマを生成します。信頼性が高く、コスト効率の高いプロトコルを定義し、定量化、HER2 内腫瘍遺伝的異質加工乳癌の大規模な一連の不均一性を比較を紹介します。
Abstract
ひと上皮成長因子受容体 2 (HER2) に対して目標とされた療法は HER2 陽性乳癌患者の結果根本的に変わった。ただし、少数の場合では、主要な臨床的課題を生成する HER2 陽性細胞の不均質分布が表示されます。日には、特性評価および大規模なコホートでHER2異種遺伝子増幅の定量化の信頼性と標準化されたプロトコルは提案されていません。複数の乳癌のさまざまな地形部分に HER2 状況を同時に把握する高スループット方法論を紹介します。特に、強化されたティッシュのマイクロ アレイ (TMAs) 腫瘍のターゲット マッピングを組み込むを作成する検査法を示します。TMA のすべてのパラメーターは、具体的には銀の in situハイブリダイゼーション (SISH) ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 乳房組織のために最適化されています。(すなわちER、PR、キ67、HER2) 予後と予測バイオ マーカーの免疫組織化学的解析自動化されたプロシージャを使用して実行してください。カスタマイズされた SISH プロトコルは、異なる固定、処理、および保管の手順を受けた複数の組織間で高品質の分子分析を許可するように実装されています。本研究では、証拠の原理特定の DNA シーケンスを効率的かつコスト効果の高い方法を使用して同時に複数の明瞭な地形区域のローカライズと異質加工乳癌できるを提供します。
Introduction
HER2が過剰に発現して、すべての侵襲乳房癌1,2の 15-30% の増幅において。HER2 過剰発現の有無による推論は > 染色 (3 +)、遺伝子増幅遺伝子コピー数は ≥6、または HER2/セントロメア比は ≥2 が評価されることができます中にカウントで強い膜免疫組織化学 (IHC) と 10% セル少なくとも 20 細胞の in situハイブリダイゼーション (っぽい)3。
内腫瘍の遺伝学的不均一性は、バイオ マーカーの評価と治療応答4潜在的有害寄稿している乳癌に広く記載されています。よると、大学のアメリカの病理学者 (CAP)、HER2 の不均一性が存在でHER2増幅される場合 > 5% と <5細胞の浸潤腫瘍の 50%。残念ながら、HER2 乳癌の空間的不均一性の実際の発生率は病理学者の間で論争の何人かの著者は、それを維持する極めてまれなイベントだし、40% の症例が他の人まで示唆HER2 異種1,5,6,7,8,9,10。にもかかわらず、この状態を支える生物学的メカニズムはまだ完全には明らかにできなかった内腫瘍 HER2 の不均一性の予後の臨床影響乳房癌患者11にとって重要であります。
最近、発色っぽい (CISH) とシルバーっぽい (SISH) など、明るいフィールド分子技術は、蛍光の ISH (魚)12と比較していくつかの利点を持つ FFPE 組織で HER2 の不均一性を検出するための信頼できる方法として浮上しています。残念ながら、単一症例のバルク分析の大規模コホート研究で非現実的なままです。いくつかのグループは、組織化学、IHC や ISH TMA 技術との組み合わせががん生物学13,14,15,16の研究で貴重な戦略を表すことができますを示唆しています。この広く採用されている方法で、異なる患者から組織サンプル分析できます同時に、組織・採用し、育成の場合14の大シリーズの一様解析試薬を最小限に抑えます。ただし、同時別処理試薬、固定時刻、および保全方法雇用などの面で、アーカイブを受けた複数の組織サンプルのハイスループット分子特性解析できるプロトコルがありません。ブロック。
乳癌の HER2 の空間的不均一性の予後および臨床的影響を与え、異質加工例の大シリーズに評価する分子統合プラットフォームを開発しました。ここでは、我々 は生成および SISH による高収率 TMAs 乳癌のHER2増幅の内腫瘍の不均一性を分析する研究所戦略を描きます。次のプロトコルを開発した腫瘍径 > 5 mm (> TNM 2017 に従って pT1b)17。小さい病変は、フルフェイスの連続切片の解析を実行することをお勧めします。私たちの手順は、ケースごとに 6 の領域 (範囲 4-8) の意味を包含まで 30 の乳癌の同時 IHC と SISH の分析のためことができます。全体で、500 μ m のコアとグリッドとエッジの間に 2 mm の間で、直径 1 mm の 180 のティッシュのコアは、TMA ブロックごとに生成されます。
Protocol
本研究は IRCCS Ca から制度上の審査委員会によって承認された ‘ グランダ財団、ポリクリニコ病院、ミラノ、イタリア。 1. 患者や組織標本の選択 すべての利用可能なヘマトキシリンとエオシン (H & E) とオリジナルの診断から IHC スライドを含む、分析するすべてのケースのアーカイブのスライドを取得し、1 つ H & E が非腫瘍性乳房組織 (例えば、手術マージ?…
Representative Results
全体的に、444 侵襲乳房癌っぽい分析用に最適化された 15 TMAs に組み込まれていた。サンプリング 2,664 スポット、2,651 (99.5%) 以前に選択したエリアの代表、以降の解析に従うと考え。内腫瘍の不均一性は腫瘍の異なる地形エリアの HER2 陽性クローンの不均質分布の特定のフォーカスを持つ IHC と SIH、により決定しました。表 3は、異なる histotypes 内 ER、PR、…
Discussion
ここでは、異質加工乳癌の高収率 TMAs のHER2遺伝子およびその対応するセントロメアの SISH 解析を実行する研究所戦略の詳細しています。このメソッドは、コスト効果の高い、乳房癌取得フォーム病理アーカイブの大規模コホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究のためのほとんどの実験室で実施することができます。
臨床的重要性のため HER2 の乳がん…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
Referências
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Citar este artigo
Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).