Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-
Summary
Heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen in einer Teilmenge von Brustkrebs beobachtet werden und erzeugt klinischen Dilemmas. Hier stellen wir eine zuverlässige und kostengünstige Protokoll zu definieren, zu quantifizieren und HER2 Intra-Tumor genetische Heterogenität in einer großen Serie von heterogen verarbeiteten Brustkrebs zu vergleichen.
Abstract
Gezielte Therapien gegen die menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) haben die Ergebnisse von Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs radikal verändert. Eine Minderheit der Fälle zeigt jedoch eine heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen, die wichtige klinischen Herausforderungen erzeugt. Bisher wurden keine zuverlässige und standardisierte Protokolle für die Charakterisierung und Quantifizierung von HER2 heterogene gen Verstärkung in großen Kohorten vorgeschlagen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Methodik um den HER2-Status gleichzeitig über verschiedene topographische Bereiche von mehreren Brustkrebs zu beurteilen. Insbesondere zeigen wir die Laborverfahren verstärkte Gewebe Microarrays (TMAs) Einbeziehung eine gezielte Zuordnung der Tumoren zu konstruieren. Alle TMA-Parameter wurden speziell für Silber in Situ -Hybridisierung () von Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Brustgewebe optimiert. Immunhistochemische Analyse der prognostische und prädiktive Biomarker (d. h., ER, PR, Ki67 und HER2) sollte mit Hilfe automatisierte Verfahren durchgeführt werden. Eine maßgeschneiderte Protokoll wurde implementiert, um eine qualitativ hochwertige molekulare Analyse über mehrere Gewebe zu ermöglichen, die unterschiedliche Fixierung, Aufbereitung und Lagerung Verfahren unterzogen. In dieser Studie bieten wir einen Proof-of-Principle, dass bestimmte DNA-Sequenzen lokalisierte gleichzeitig in verschiedene topographische Bereiche von mehreren und heterogen verarbeiteten Mammakarzinome mit einer effizienten und kostengünstigen Methode sein könnte.
Introduction
HER2 ist ein Protoonkogenproduktes, das überexprimiert und verstärkt in 15-30 % aller invasiven Brustkrebs Krebs1,2. HER2-Überexpression wird abgeleitet durch das Vorhandensein von > 10 % Zellen mit starken Membran immunhistochemische (IHC) Färbung (3 +), während die gen-Amplifikation beurteilt werden kann, wenn das HER2/Zentromer-Verhältnis ≥2 ist oder die gen-Kopie-Anzahl ≥6 ist, zählen auf mindestens 20 Zellen durch in Situ Hybridisierung (ISH)3.
Intra-Tumor genetische Heterogenität ist weit verbreitet in Brustkrebs, einen möglichen negativen Beitrag zu Biomarkern Bewertung und Behandlungen Antwort4beschrieben worden. Nach dem College der amerikanischen Pathologen (GAP), HER2 Heterogenität liegt vor, wenn bei HER2 verstärkt ist > 5 % und < 50 % der Infiltration Tumor Zellen5. Bedauerlicherweise die tatsächliche Häufigkeit von HER2 räumliche Heterogenität in Brustkrebs bleibt ein Thema der Kontroverse unter den Pathologen mit einigen Autoren, die Pflege, es ist ein äußerst seltenes Ereignis, andere darauf hindeutet, dass bis zu 40 % der Fälle sind HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Trotz der biologischen Mechanismen, die diese Bedingung zu untermauern sind nicht noch vollständig geklärt die prognostischen und klinischen Auswirkungen der Intra-Tumor HER2 Heterogenität sind entscheidend für Brust Krebs Patienten11.
Vor kurzem entstanden Hellfeld Molekulare Techniken, wie chromogenen ISH (CISH) und Silber ISH (), als zuverlässige Methoden, HER2-Heterogenität in FFPE Gewebe, mit einigen Vorteilen im Vergleich zu Leuchtstofflampen ISH (Fisch)12zu erkennen. Leider bleibt die Massenanalyse von einzelnen Fällen unpraktisch in großen Kohorte-Studien. Mehrere Gruppen haben vorgeschlagen, dass die Kombination von Histochemie, IHC und ISH mit TMA-Technologien eine sinnvolle Strategie in der Studie von Krebs Biologie13,14,15,16darstellen könnte. Mit dieser weit verbreiteten Methode können Gewebeproben aus verschiedenen Patienten gleichzeitig, Minimierung der Gewebe und Reagenzien beschäftigt und dabei fördern die einheitliche Analyse einer großen Reihe von Fällen14analysiert werden. Jedoch gibt es keine Protokolle für die gleichzeitige Hochdurchsatz-molekulare Charakterisierung der mehrere Gewebeproben, die unterschiedliche Verarbeitung im Hinblick auf die Reagenzien, Fixierung Zeiten und Konservierungsmethoden eingesetzt, solche wie Archivierung unterzogen Blöcke.
Angesichts der prognostischen und klinischen Auswirkungen der HER2 räumliche Heterogenität in Brust-, entwickelten wir eine integrierte molekulare Plattform um es in großen Serien heterogen bearbeiteten Fälle zu beurteilen. Hier zeigen wir die Labor-Strategien zur Erzeugung und Analyse der Intra-Tumor Heterogenität der HER2 -Amplifikation in hochverzinsliche TMAs von Brustkrebs mittels. Das folgende Protokoll wurde entwickelt für Tumoren messen > 5 mm (> pT1b nach der TNM-2017)17. Für kleinere Läsionen empfehlen wir die Durchführung der Analyse auf Full-Face Schnittserien. Unser Verfahren ermöglicht die gleichzeitige IHC und Analyse von bis zu 30 Brustkrebs, mit einem Mittelwert von 6 verschiedene Bereiche (Bereich 4-8) für jeden Fall. Insgesamt werden 180 Gewebe Kerne von 1 mm im Durchmesser, mit 500 µm zwischen den Kernen und 2 mm zwischen dem Netz und Kanten für jeden TMA-Block generiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir die Labor-Strategien Analysen das HER2 -gen und seine entsprechenden Zentromer in hochverzinsliche TMAs der heterogen verarbeiteten Mammakarzinome durchführen detaillierte. Diese Methode ist kostengünstig und kann in den meisten Labors für die Untersuchung von HER2 Gens Verstärkung Heterogenität in großen Kohorten der Brust Krebs abgerufen Form Pathologie Archive durchgeführt werden.
Aufgrund der klinischen Bedeutung des HER2 Tests bei Brustkrebs und die…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keine.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
Referências
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