Distribuição heterogênea de células HER2-positivo pode ser observada em um subconjunto dos cancros da mama e gera dilemas clínicas. Aqui, apresentamos um protocolo confiável e econômico para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética de HER2 intra-tumor em uma grande série de cancros da mama de forma heterogénea transformados.
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Artigo de método
Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama
Neste artigo
Resumo
Resumo
Terapias alvo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 mudaram radicalmente os resultados dos pacientes com câncer de Mama HER2-positivo. No entanto, uma minoria de casos exibe uma distribuição heterogênea de células HER2-positivo, que gera grandes desafios clínicos. Até à data, não há protocolos confiáveis e padronizados para a caracterização e quantificação de amplificação de gene HER2 heterogênea em grandes coortes têm sido propostos. Aqui, apresentamos uma metodologia de alta produtividade para avaliar simultaneamente o status HER2 em diferentes áreas topográficas de vários cancros da mama. Em particular, ilustramos o procedimento laboratorial para construir aprimorado os microarrays do tecido (TMAs) incorporando um mapeamento alvo dos tumores. Todos os parâmetros TMA foram otimizados especificamente para a prata em situ da hibridação (SISH) de formalina-parafina (FFPE) mama tecidos fixados. Análise imunohistoquímica de biomarcadores os prognósticos e preditivos (isto é, ER, PR, Ki67 e HER2) deve ser realizada utilizando procedimentos automatizados. Um protocolo personalizado de SISH foi implementado para permitir uma análise molecular de alta qualidade através de vários tecidos que passou por diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Neste estudo, nós fornecemos um prova de princípio que sequências específicas de DNA pode ser câncer de mama de forma heterogénea transformados e simultaneamente localizadas em áreas topográficas distintas de múltiplos usando um método eficiente e econômico.
Introdução
HER2 é um proto-oncogene que é overexpressed e amplificado em 15-30% de mama invasivo todos os cancros1,2. Superexpressão de HER2 é inferido pela presença de > 10% células com membrana forte imuno-histoquímica (IHC) coloração (3 +), enquanto a amplificação do gene pode ser avaliada quando a proporção de HER2/Centrómero é ≥2 ou o número de cópia do gene é ≥ 6, na contagem de pelo menos 20 células por em situ da hibridação (ISH)3.
Heterogeneidade genética intra-tumor tem sido amplamente descrita em cânceres de mama, sendo um contribuinte poten....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelas placas de revisão institucional da IRCCS Ca' Granda Foundation, Hospital Policlínico, Milão, Itália.
1. seleção de pacientes e espécimes de tecido
- Recuperar os slides arquivamento de todos os casos a serem analisados, incluindo todos os disponível hematoxilina e eosina (H & E) e slides de IHC do diagnóstico original e, se estiver presente, um H & E de correspondem tecido mamário não-neoplásicos (por exemplo, margem cirúrgica) .
-
Execute avaliações de caso.
Nota: Para esta tarefa, pelo menos dois patologistas com experiência em patologia mamária devem discutir os....
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Resultados
Em geral, 444 mama invasivo cânceres foram incorporados em 15 TMAs especificamente otimizados para análises ISH. Entre os 2.664 pontos amostrados, 2.651 (99,5%) eram representativas das áreas previamente selecionadas e, portanto, considerado favorável para análises subsequentes. Heterogeneidade de intra-tumor foi determinada por meio de IHC e SIH, com particular ênfase para as distribuições heterogêneas de clones de HER2-positivo nas áreas topográficas distintas dos tumores. Tabel.......
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Discussão
Aqui, temos as estratégias de laboratório para realizar análises SISH do gene HER2 e sua correspondente Centrómero em alto rendimento TMAs dos cancros da mama de forma heterogénea transformados detalhados. Este método é econômico e pode ser realizado na maioria dos laboratórios para o estudo da heterogeneidade de amplificação do gene HER2 em grandes coortes de mama câncer obtida forma patologia archives.
Devido a importância clínica do HER2 testes em câncer de mama e os desaf.......
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Divulgações
Os autores não têm nenhum conflito de interesses.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE | 39601006 | Meio de incorporação de tecidos, 56 ° C ponto de fusão |
| Eosin Y solução aquosa a 1% | Bio Optica, Milão, Itália, UE | 510002 | Eosin amarelado, solúvel em água |
| Carazzi' s hematoxilina | Bio Optica, Milão, Itália, UE | 506012 | Hematoxilina de alúmen amadurecida com iodato de potássio |
| Qualidade de diamante | Laboindustria, Arzergrande, Itália, UE | 33533 | Lâminas de microscópio de 26x76 mm |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE | 14046430011 | Meio de montagem, sem monômeros, à base de polímeros de butilmetacrilato em lâminas de microscópio de xileno |
| FLEX IHC | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, EUA | K8020 | Lâminas de microscópio revestidas para adesão de FFPE para uso no sistema médico IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana, Tucson, AZ, EUA | N750-BMKU-FS | Sistema de coloração de lâminas |
| CONFIRMAR anti-Receptor de estrogênio (ER) (SP1) Anticorpo primário monoclonal de coelho | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 790-4324 | Anticorpo primário, pronto para uso |
| CONFIRMAR anti-Receptor de Progesterona (PR) (1E2) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 790-2223 | Anticorpo primário, pronto para uso |
| CONFIRMAR anti-Ki-67 (30-9) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 790-4286 | Anticorpo primário, pronto para uso |
| PATHWAY HER2 (4B5) Anticorpo Primário Monoclonal de Coelho | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 790-4493 | Anticorpo primário, pronto para uso |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 760-500 | Sistema indireto, livre de biotina, para detecção de IgG de camundongo, IgM de camundongo e anticorpos primários |
| de coelho INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Ensaio Dual ISH - Hibridização in situ de duas cores Ensaio automatizado aprovado pela FDA para determinar o status do gene HER2 em pacientes com câncer de mama |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection | Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Usado no processo ISH para remover a proteína que envolve as sequências de DNA alvo de interesse |
| Hematoxilina | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 760-2021 | Reagente de contracoloração de hematoxilina de Gill modificado |
| Sistema médico Ventana de contracoloração | , Tucson, AZ, EUA | 790-2208 | Reagente de contracoloração de hematoxilina de Meyer modificado Reagente |
| de contracoloração de azulado | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 760-2037 | Solução aquosa de carbonato de lítio tamponado para seções coradas de hematoxilina azulada em lâminas de vidro |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Tampão à base de formamida para ensaios |
| ISH EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Solução concentrada para remoção de parafina de amostras de tecido durante reações IHC e ISH e para diluir 1:10. |
| Tampão SSC (10X) | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 950-110 Cloreto de | sódio A solução tampão de citrato de sódio é usada para lavagens rigorosas e para enxaguar lâminas entre as etapas de coloração e fornecer um ambiente aquoso estável para as reações de hibridização in situ. Diluir 1:5. |
| Sistema médico ULTRA LCS | Ventana, Tucson, AZ, EUA | 650-210 | Solução de lamínula pré-diluída (pronta para uso) usada como barreira entre os reagentes aquosos e o ar para evitar a evaporação nas reações IHC e ISH |
| Tampão de reação (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, EUA | 950-300 | Solução tampão à base de Tris (pH 7,6 ± 0,2) para enxaguar as lâminas entre as etapas de coloração durante IHC e ISH. Diluir 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Etapas de pré-tratamento no processamento de amostras de tecido durante IHC e ISH. Pronto para usar. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Sistema médico Ventana, Tucson, AZ, EUA | 780-003 | Solução pronta para uso para enxaguar lâminas entre as etapas de coloração IHC e ISH |
| Micrótomo | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE | RM 2255 | Micrótomo rotativo automatizado |
| Multicorador | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE | ST 5020 | Estação de trabalho para coloração e lamínula automatizadas |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, França, UE | 00-MICO-1 | Arrayer semiautomático para construção de TMA com software incorporado TMA Designer 2 |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha, UE | K080254 | Dispositivo de captura de imagem - scanner de patologia digital |
| Tissue-Tek III Uni- | Sakura Finetek Europe BV | 4135 | |
| Tecido-Tek Paraform Molde de Base Padrão | Sakura Finetek Europe BV | 7055 | Molde de metal base de aço inoxidável |
Referências
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M.
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Reimpressões e permissões
