Heterogen fördelning av HER2-positiva celler kan observeras i en delmängd av bröstcancer och genererar kliniska dilemman. Här introducerar vi en pålitlig och kostnadseffektiv protokoll för att definiera, kvantifiera och jämföra HER2 intra-tumör genetisk heterogenitet i en stor serie av heterogeneously bearbetade bröstcancer.
Riktade terapier mot human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) har radikalt förändrat resultatet hos patienter med HER2-positiv bröstcancer. Ett fåtal fall visar emellertid en heterogen fördelning av HER2-positiva celler, som genererar stora kliniska utmaningar. Hittills har har inga tillförlitliga och standardiserade protokoll för karakterisering och kvantifiering av HER2 heterogena gen amplifiering i stora kohorter föreslagits. Här presenterar vi en hög genomströmning metod för att samtidigt bedöma den HER2-statusen i olika topografiska områden av flera bröstcancer. I synnerhet illustrera vi det laboratorieförfarande att konstruera förbättrade vävnad microarrays (TMAs) införliva en riktade mappning av tumörer. Alla TMA parametrar har optimerats speciellt för den silver i situ -hybridisering (SISH) av formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) bröstvävnad. Immunhistokemisk analys av de prognostiska och Prediktiva biomarkörer (dvs, ER, PR, Ki67 och HER2) bör utföras med automatiserade procedurer. En anpassad SISH-protokoll har genomförts för att möjliggöra en hög kvalitet molekylär analys över flera vävnader som genomgick olika förfaranden för fixering, bearbetning och lagring. I denna studie ger vi ett proof-of-principle att specifika DNA-sekvenser kan vara lokaliserade samtidigt i skilda topografiska områden av flera och heterogeneously behandlas bröstcancer med hjälp av en effektiv och kostnadseffektiv metod.
HER2 är en proto-onkogener som i ökad utsträckning och förstärks i 15-30% av alla invasiva breast cancer1,2. HER2 överuttryck är slutsatsen av närvaron av > 10% celler med stark membran immunhistokemisk (IHC) färgning (3 +), medan den gen förstärkningen kan bedömas när HER2/centromer förhållandet är ≥2 eller antalet gen kopia är ≥6, på inventering på minst 20 celler genom in situ hybridisering (ISH)3.
Intra-tumör genetisk heterogenitet har varit allmänt beskrivs i bröstcancer, att vara ett potentiellt negativa bidrag till biomarkörer utvärdering och behandlingar svar4. Enligt den College av amerikanska patologer (GJP), HER2 olikheter finns om HER2 förstärks i > 5% och < 50% av infiltrera tumör celler5. Tyvärr, den faktiska förekomsten av HER2 rumslig heterogenitet i bröstcancer är fortfarande föremål för kontroverser bland patologer, med några författare att upprätthålla som det är en ytterst sällsynt händelse och andra tyder på att upp till 40% av fallen är HER2-heterogen1,5,6,7,8,9,10. Trots de biologiska mekanismer som ligger till grund för detta tillstånd är ännu inte fullt klargöras inte, de prognostiska och kliniska effekterna av intra-tumör HER2 heterogenitet är avgörande för bröstcancer cancer patienter11.
Ljusa fält molekylära tekniker, såsom kromogen ISH (CISH) och silver ISH (SISH), har nyligen dykt upp som tillförlitliga metoder för att upptäcka HER2 heterogenitet i FFPE vävnader, med vissa fördelar jämfört med fluorescerande ISH (fisk)12. Tyvärr, bulk analys av enstaka fall förblir opraktiskt i stor-kohort forskningsstudier. Flera grupper har föreslagit att kombinationen av histokemi, IHC och ISH med TMA teknik kan utgöra en värdefull strategi i studien av cancer biologi13,14,15,16. Med den här allmänt antagna metoden kan vävnadsprover från olika patienter analyseras samtidigt minimera vävnad och reagenser sysselsatt och därmed främja en enhetlig analys av ett stort antal fall14. Det finns dock inga protokoll för samtidig hög genomströmning molekylär karakterisering av flera vävnadsprover som genomgick olika behandling i form av reagenser, fixering gånger och bevarande metoder sysselsatta, sådan som arkivens block.
Prognostisk och klinisk konsekvenserna av HER2 rumslig heterogenitet i bröstcancer får utvecklat vi en integrerad molekylär plattform för att bedöma det i stora serier av heterogeneously bearbetade fall. Här, skildra vi de laboratorium strategierna för att generera och analysera intra-tumör heterogenitet HER2 amplifiering i högavkastande TMAs av bröstcancer genom SISH. Följande protokoll har utvecklats för tumörer mätning > 5 mm (> pT1b enligt den TNM 2017)17. För mindre lesioner rekommenderar vi utför analysen på heltäckande ansiktsskydd seriell avsnitt. Vårt förfarande möjliggör samtidiga IHC och SISH analys av upp till 30 bröstcancer, som omfattar ett medelvärde på 6 olika områden (intervall 4-8) för varje fall. Sammanlagt kommer 180 vävnad kärnor 1 mm i diameter, med 500 µm mellan kärnor och 2 mm mellan rutnät och kanter att genereras för varje TMA-block.
Här, har vi detaljerade strategier för laboratoriet att utföra SISH analyser av HER2 -genen och dess motsvarande Centromeren i högavkastande TMAs av heterogeneously bearbetade bröstcancer. Metoden är kostnadseffektiv och kan utföras i de flesta laboratorier för studien av HER2 genen förstärkning heterogenitet i stora kohorter av bröst cancer Hämtad form patologi arkiv.
På grund av den kliniska betydelsen av HER2 testning i bröstcancer och de utmaningar som gener…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |