Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여
Summary
현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.
Abstract
신 부유한 반복 키 2 (LRRK2)에 돌연변이 가족성 파 킨 슨 병 (FPD) 연결 될 표시 되었습니다. LRRK2의 키 니 아 제 활동의 비정상적인 활성화 PD의 병 인에 연루 되어, 이후 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 생리 적인 수준을 평가 하는 방법을 확립 필수적입니다. 최근 연구는 LRRK2 랩 GTPase 가족, Rab10를 포함 하 여 생리 적 조건 하에서 phosphorylates 밝혔다. Immunoblotting에 대 한 현재 사용할 수 있는 인 산화 특정 항 체의 불 쌍 한 감도 때문에 의해 그것을 감지 하기 어려운 되었습니다 LRRK2 경작된 한 세포에 의해 내 생 Rab10의 인 산화는 질량 분석에 의해 검출 될 수, 있지만 Rab10입니다. 여기, 우리는 간단한 설명 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지 방식의 immunoblotting 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 인산 염-바인딩 태그 (태그 P)를 함께 활용 하 여 기반을 N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N’,N’-트리 스 (pyridin-2-yl-메 틸)-1, 3-diaminopropan-2-올. 현재 프로토콜 P 태그를 활용 하는 방법의 예제를 제공 뿐만 아니라 또한 어떻게 돌연변이 억제 물 치료/관리 또는 어떤 다른 요인 든 지의 세포와 조직에 LRRK2 하류 신호을 변경의 평가 가능 하 게 .
Introduction
PD 주로 영향을 미치는 dopaminergic 신경은 midbrain에 노인1모터 시스템의 장애에서 발생 하는 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 대부분의 환자는 산발적으로 PD를 개발, 질병을 상속 하는 가족이 있습니다. FPD2연결 될 몇몇 유전자에 돌연변이 발견 되었습니다. FPD에 대 한 원인 유전자 중 하나입니다 LRRK2, 8 개의 missense 돌연변이 (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, 및 I2020T) 라는 PARK8 지배적 상속된 FPD에 연결 보고3,,45를 지금까지 있다. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 산발적 PD 환자 또한 식별 LRRK2 로커 스에서 게놈 변이 위험 요인으로 PD, 제안 LRRK2의 기능에 이상이 모두 산발적 neurodegeneration의 일반적인 원인에 대 한 그리고 PARK8 FPD6,,78.
LRRK2 신 부유한 반복 도메인, 복잡 한 단백질 (ROC) 도메인, ROC (오호) 도메인, 떠들고/트레오닌 단백질 키 니 아 제 도메인 및 WD40 반복 도메인9의 C-터미널의 GTP 바인딩 Ras 구성 된 큰 단백질 (2,527 아미노산) 이다. 8 FPD 돌연변이 찾을 이러한 기능 도메인; N1437H 그리고 R1441C/G/H/S ROC 도메인, 오호 도메인, G2019S 및 I2020T 키 도메인에서 Y1699C. 가정 했다 이후로 PD 환자10,,1112에 돌연변이 발견 가장 자주, G2019S 돌연변이 체 외에서2-3 배13LRRK2의 키 니 아 제 활동 증가, LRRK2 substrate(s)의 인 산화의 비정상적인 증가 신경에 독성입니다. 그러나, 그것은 되었습니다 하지 순수 관련 LRRK2 기판의 인 산화 환자 파생된 샘플에서 평가 하는 방법의 부족으로 인해 가족/산발적 PD 환자에서 변경 여부를 공부 하.
단백질 인 산화는 일반적으로 immunoblotting 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 특히 대량 spectrometric 분석 하거나 단백질의 phosphorylated 상태를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그러나, 전 전략 때로는 적용할 수 없습니다 인 산화 특정 항 체를 만드는 어려움 때문에. 방사성 인산 염 세포의 신진 대사 라벨 인 산화 특정 항 체는 쉽게 사용할 수 때 인 산화의 생리 적 수준 검사 다른 옵션입니다. 그러나, 그것은 많은 양의 방사성 물질을 필요로 하 고 따라서 radioprotection14에 대 한 몇 가지 특수 장비를 포함 한다. 대량 spectrometric 분석은 더 민감한이 토론 방법에 비해 고 단백질 인 산화 분석에서 대중적 되었다. 그러나, 샘플 준비 시간 이다-소모, 그리고 비싼 악기는 분석을 위해 필요 합니다.
직접적인 생리 기판 LRRK2 대규모 phosphoproteomic 분석15의 결과에 따라 Rab10와 Rab8를 포함 하 여 랩 GTPase 가족의 부분 집합 최근에 알려졌다. 우리는 다음 Rab10 인 산화 FPD 돌연변이 마우스16를 쫓 고의 폐와 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 의해 증가 되었다 설명 했다. 이 보고서에서 우리는 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)을 선택-P 태그 분자는 SDS 페이지 젤 (P 태그 SDS 페이지) 검색 Rab10 인 산화의 내 생 수준으로 공동 polymerized 메서드를 기반으로 때문에 phosphorylated Rab10에 대 한 특정 높게 과민 한 항 체는 여전히 부족 했다. 우리는 총 Rab8에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체의 가난한 선택으로 인해 생 Rab8의 인 산화를 감지 하지 못했습니다. 따라서, 우리는 Rab10 인 산화에 집중 하기로 결정 했다. LRRK2는 Thr73 높은 보존 “스위치” II 영역의 중간 위치에서 Rab10를 phosphorylates. Rab 단백질 중 인 산화 위치의 높은 보존 별개 Rab 단백질을 인식 하는 phosphospecific 항 체 확인 하기 어려운 이유 중 하나를 수 있습니다.
LRRK2에 의해 Rab8A의 인 산화 Rabin8, 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF) GTP15바인딩된 GDP를 교환 하 여 Rab8A를 활성화의 바인딩을 억제. Rab10 및 Rab8A LRRK2에 의해의 인 산화는 또한 GDP 분리 억제제 (GDIs),이 Rab 단백질의 활성화에 필수적인 막15에서 GDP 바인딩된 Rab 단백질을 추출 하 여 바인딩을 억제. 그 랩으로 LRRK2 단백질의 인 산화에서에서 그들을 방지 활성화는 정확한 분자 메커니즘 및 생리 적인 결과 인 산화의 불분명 남아 있지만 가정은 했다.
P 태그 SDS 페이지 기노시타 외. 2006 년에 발명 했다:이 방법에서는, 아크릴은 covalently와 결합 하 여 P 태그, 캡처 SDS 페이지에 copolymerized 높은 선호도와 인산 염 분자 젤17. SDS 페이지 젤에서 P 태그 분자는 선택적으로 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체, 때문에 P 태그 SDS 페이지 phosphorylated 아닌 것 들 로부터 phosphorylated 단백질을 분리할 수 있습니다 (그림 1). 관심의 단백질은 여러 잔류물에 phosphorylated, 차동 phosphorylated 모양에 해당 하는 밴드의 사다리 관찰 됩니다. Rab10의 경우 우리는 Rab10 Thr73에만 phosphorylated는 나타내는 하나만 이동된 밴드를 관찰 합니다. 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting P 태그 SDS 페이지의 주요 장점은 phosphorylated Rab10 immunoblotting 비 인 산화 특정 항 체 (즉, 인식 총 Rab10)와 의해 검출 될 수 있다 세포 막에 전송 되 고, 후는 일반적으로 더 민감한, 구체적이 고 사용할 수 있는 상업/학술 소스에서. P 태그 SDS 페이지를 사용 하 여의 또 다른 장점은 이다 그 하나 얻을 수 있다 인 산화를의 산출할의 대략적인 추정 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting 또는 방사성을 가진 세포의 신진 대사 라벨는 불가능 인산 염입니다.
저렴 한 P 태그 아크릴 및 그것에 관련 된 몇 가지 사소한 수정 사용 떨어져 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 검출에 대 한 현재 메서드 immunoblotting의 일반 프로토콜을 다음과 같습니다.따라서, 간단 하 고 쉽게 실행 immunoblotting은 평소 연습, 순화 된 단백질, 세포 lysates 조직 homogenates를 포함 하는 샘플의 어떤 종류와 어떤 실험실에서 이어야 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리 감지 LRRK2 P 태그 방법론에 따라 내 생 수준에 의해 인 산화 Rab10 손쉬운 강력한 방법을 설명 합니다. Phosphorylated Rab10에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체 overexpressed 단백질15만으로 작동을 하기 때문에 P 태그 SDS 페이지를 활용 하 여 현재 메서드 Rab10 인 산화의 내 생 수준을 평가 하는 유일한 방법입니다. 또한, 현재 메서드는 셀에 Rab10 인 산화의 산출할 추정 수 있습니다…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 친절 하 게 제공 하는 인코딩 3xFLAG LRRK2 WT 및 돌연변이 플라스 미드에 대 한 박사 타 케시 Iwatsubo (동경, 일본) 감사 합니다. 우리는 또한 친절 하 게 제공 MLi-2와 HA Rab10 인코딩 플라스 미드에 대 한 박사 다리오 Alessi (던 디 대학, 영국) 감사 합니다. 이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 JP17K08265 (병사는)에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
Referências
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