تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"
Summary
ويصف هذا البروتوكول نظام تعبير بروتين الصدمة الناجمة عن حرارة (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)، التي يمكن استخدامها للتعبير عن البروتينات الخارجية أو تقييم apoptotic مكافحة نشاط البروتينات الخارجية المحتملة وما مبتوراً الأمينية الأحماض في خلايا الحشرات.
Abstract
نظام التعبير الجيني عابر واحد من أهم التقنيات لإجراء تحليل وظيفي البروتين في منظومة الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. تم تطوير هذا النظام للجينات صريح الأجنبية الخاضعة لسيطرة المروج باكولوفيرال في التعبير عابر والبلازميدات. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النظام على مقايسة وظيفية للبروتينات الخارجية أو باكولوفيروس نفسها. تطوير نظام التعبير الجيني عابر المتاحة تجارياً وعلى نطاق واسع أكثر استناداً إلى مروج فوري مطلع الجينات (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف). ومع ذلك، لوحظ وجود مستوى تعبير منخفضة من الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات. ولذلك، شيد نظام تعبير الجيني عابرة لتحسين التعبير البروتين. في هذا النظام، وشيدت والبلازميدات المؤتلف تحتوي على تسلسل الهدف تحت مراقبة الحرارة المورفولوجية المروج (Dhsp70) صدمة 70. ويقدم هذا البروتوكول تطبيق هذه الحرارة المستندة إلى صدمة بدهسب/V5-صاحب (حانمه V5 مع الحامض الأميني 6)/فروجيبيردا سبودوبتيرا خلية النظام (الخلايا sf9)؛ يتوفر هذا النظام ليس فقط للتعبير الجيني ولكن أيضا لتقييم نشاط مكافحة apoptotic مرشح البروتينات في خلايا الحشرات. وعلاوة على ذلك، هذا النظام يمكن أن يكون أما transfected مع بلازميد المؤتلف واحد أو شارك transfected اثنين والبلازميدات المؤتلف معادية محتملة وظيفيا في خلايا الحشرات. البروتوكول يوضح كفاءة هذا النظام ويوفر حالة عملية لهذا الأسلوب.
Introduction
نظامان التعبير البروتين قد استخدمت عادة لإنتاج البروتينات: prokaryote البروتين التعبير (نظام التعبير الجينيالإشريكيّة القولونية ) والنظم eukaryote البروتين التعبير. نظام التعبير البروتين eukaryote شعبية واحد هو باكولوفيروس التعبير ناقل النظام (بيفس)1. واستخدمت باكولوفيروسيس أولاً كعوامل المكافحة البيولوجية في العالم الزراعية والغابات الآفات. في العقود القليلة الماضية، وضعت باكولوفيروسيس كأدوات التكنولوجيا الحيوية للبروتين، فضلا عن ناقلات التعبير. جينوم باكولوفيروسيس تتكون من DNA دائرية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل والمغلفة نوكليوكابسيدس2. وحتى الآن، أكثر من ثمانية وسبعون باكولوفيروس قد يعزل التسلسل3. استناداً إلى تتالي الزمانية باكولوفيرال تعبيرات الجين في الخلايا المضيفة الحشرات، يمكن تصنيف النسخ الجيني في الشلالات الزمانية الأربعة، بمن فيهم فوري مطلع، الجينات تأخر-المبكر والمتأخر، ومتأخرة جداً4.
وتم تعيين بيفس حيث أن مروجي الجينات متأخرة جداً (أي، متعدد الوجوه أو p10 المروج) واستخدمت محرك الجينات المستهدفة، بينما باكولوفيروس المؤتلف تم إنشاؤها بواسطة جزئ مثلى. التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات التي باكولوفيروس المؤتلف شبيه بالبروتينات الثدييات في التعديلات بوستترانسلاشونال (مناسبة لإنتاج بروتين سكري). وهكذا، تم باكولوفيروس تستخدم على نطاق واسع5،،من67. بيد أن القيد واحد هو وجود مسارات glycosylation ن مختلفة في خلايا الحشرات7.
ولذلك، تم وضع نظام جديد لتعبير باكولوفيروس، النظام الجينات عابرة، والتعبير. هذا النظام وتعرب عن الجينات الأجنبية تحت محرك أقراص المروجين فوري مطلع باكولوفيرال (أي 1 المروج) في خلايا الحشرات. باستخدام هذا النظام، البروتين المستهدف يمكن مباشرة التعبير عن تحت سيطرة المروج 1-أي أثناء تعديل مسار N-جليكوسيلاتيون في خلايا الحشرات، أسفر عن أفضل oligosaccharides ن مرتبط7. علاوة على ذلك، يتم نسخها من قبل الخلية المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني الجينات فوري مطلع باكولوفيرال ولا تتطلب أي عامل فيروسي لتفعيل4. ولذلك، يمكن التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات في فترة زمنية قصيرة. حتى الآن، عابرة نظام التعبير الجيني واحدة من أهم التقنيات لإجراء فحوصات البروتين الوظيفية في نظام الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. يمكن تطبيق هذا النظام لتحليل الدالة باكولوفيروس أو البروتينات الخارجية. أحد أنظمة تعبير الجينات عابرة المتاحة تجارياً يرتكز على مروجي الجينات فوري مطلع (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف) (المروجين OpIE2 و OpIE1).
ومع ذلك، انخفاض مستوى تعبير الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات لا تزال تمثل مشكلة عندما كان النظام تعبير الجينات عابرة المستندة إلى مروج OpIE تستخدم8،،من910. وهكذا، شيد نظام التعبير الجيني عابر آخر استناداً إلى مروج المورفولوجية الحرارة صدمة بروتين 70 (hsp70) الجينات8،9. مروج hsp70 يعمل أكثر كفاءة من مروج باكولوفيرال IE عند الناجمة عن صدمة الحرارة في خلايا الحشرات10. وأعرب عن الجينات المستهدفة في هذا النظام، تحت محرك الأقراص من المورفولوجية الحرارة صدمة 70 المروج (Dhsp70). يمكن بسهولة استنساخ جينات أجنبية إلى بلازميد التعبير الجيني عابر بأساليب الاستنساخ القائم على بكر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها التحكم في توقيت للتعبير الجيني بالاستقراء صدمة الحرارة.
في هذا التقرير، اتبع النهج ونعرب عن ثلاثة ترونكيشنز مختلفة من الجينات باكولوفيرال (مثبط للمبرمج 3، iap3 من إكسيلينا ليمانتريا منبف) باستخدام نظام التعبير المستندة إلى صدمة بروتين عابر الحرارة و كذلك تنطبق هذه البروتينات أعرب في تحليل نشاط مكافحة–أبوبتوتيك. أما التعبير عن البروتينات الخارجية بسرعة هذا النظام أو تطبق كذلك على تقييم نشاط مكافحة أبوبتوتيك البروتين في الخلايا sf9، بينما أيضا وجود إمكانات ليتم تطبيقها على فحوصات نشاط البروتين الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
ووصف مفهوم النظام القائم على صدمة خلية بدهسب/V5-صاحب/sf9 الحرارة أولاً كليم et al. في عام 19948. أظهرت مقارنة باكولوفيرال الجينات المروج (IE1) و المورفولوجية hsp70 أن hsp70 كان مستوى أعلى من كفاءة في البعوض خلايا10. وعلاوة على ذلك، بسبب تحريض صدمة الحرارة، يمك?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور جيان-Horng لوي من المعهد “علم الأحياء البحرية”، جامعة المحيط تايوان الوطنية لتوفير 3 بلازميد الإنشاءات. وأيد هذا البحث بمنحه 106-2311-ب-197-001-من وزارة العلوم والتكنولوجيا (معظم).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
