昆虫细胞 (sf9) 外源基因在蛋白质功能检测中的瞬态表达
Summary
本协议描述了一种热休克诱导蛋白表达系统 (pDHsp/V5-His/sf9 细胞系统), 可用于表达外来蛋白或评价潜在外来蛋白的抗凋亡活性及其截断的氨基酸昆虫细胞中的酸。
Abstract
瞬态基因表达系统是在杆状病毒体外细胞培养系统中进行蛋白质功能分析的重要技术之一。该系统是在瞬态表达质粒中杆状病毒启动子控制下表达国外基因的一种方法。此外, 该系统可应用于杆状病毒本身或外来蛋白质的功能检测。以Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) 的直接早期基因启动子为基础, 建立了最广泛、最商业化的瞬时基因表达系统。然而, 在昆虫细胞中发现外来基因的表达水平较低。因此, 构建了一种用于改善蛋白质表达的瞬态基因表达系统。在该系统中, 构建了重组质粒, 以包含在果蝇热休克 70 (Dhsp70) 启动子控制下的目标序列。本协议介绍了这种基于热休克的 pDHsp/V5-His (V5 表位与6组氨酸)/斜纹 frugiperda细胞 (sf9 细胞) 系统的应用;该系统不仅用于基因表达, 而且可用于评价昆虫细胞中候选蛋白的抗凋亡活性。此外, 该系统可以转染一个重组质粒或联合转染两个潜在的功能拮抗重组粒的昆虫细胞。该协议证明了该系统的有效性, 并提供了该技术的实际应用实例。
Introduction
两种蛋白表达系统通常用于生产蛋白质: 原核生物蛋白表达系统 (大肠杆菌基因表达系统) 和真核细胞蛋白表达系统.一种流行的真核细胞蛋白表达系统是杆状病毒表达载体系统 (BEVS)1。杆状首次被用作全球农业和森林害虫的生物控制剂。在过去的几十年中, 杆状被开发为蛋白质表达载体的生物技术工具。杆状的基因组由双链循环 DNA 和封装 nucleocapsids2组成。到目前为止, 已有七十八多个杆状病毒分离序列3。根据寄主昆虫细胞杆状病毒基因表达的时间级联, 基因转录可分为四个颞叶栅, 包括即刻早、延迟早、晚期和非常晚的基因 4.
BEVSs 被指定为非常晚基因促进者 (即, 多面体或 p10 启动子) 被用来驱动目标基因, 而重组杆状病毒是由同源重组产生的。重组杆状病毒在昆虫细胞中的外蛋白表达与转化后修饰的哺乳动物蛋白相似 (适合于糖蛋白的生成)。因此, 杆状病毒已被广泛使用5,6,7。然而, 一个限制是在昆虫细胞中存在着不同的 n-糖基化通路7。
因此, 建立了一种新的杆状病毒表达系统–瞬态基因表达系统。该系统在昆虫细胞中杆状病毒直接早期促进剂 (ie-1 启动子) 驱动下表达国外基因.通过使用该系统, 可以在ie-1启动子的控制下立即表达目标蛋白, 同时修改昆虫细胞中的 n-糖基化通路, 从而得到更好的 n-链寡糖7。此外, 杆状病毒直接早期基因由宿主细胞 RNA 聚合酶 II 转录, 不需要任何病毒因子激活 4.因此, 在短时间内, 外来蛋白可以在昆虫细胞中表达。目前, 瞬态基因表达系统是在杆状病毒体外细胞培养系统中进行蛋白质功能测定的重要技术之一。该系统可用于分析杆状病毒或外来蛋白质的功能。一个商业上可用的瞬态基因表达系统是基于直接早期基因 (IE) 促进者的Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 和 OpIE1)。
然而, 当奥佩启动子的瞬态基因表达系统使用8,9,10时, 昆虫细胞外基因的表达水平仍然是一个问题。因此, 根据果蝇热休克蛋白 70 (hsp70) 基因8,9的启动子, 构建了另一个瞬时基因表达系统。在昆虫细胞的热休克诱导下, hsp70 的启动子比杆状病毒 IE 启动子更有效 10.在该系统中, 目标基因在果蝇热休克 70 (Dhsp70) 启动子的驱动下表达。利用 PCR 克隆方法可以很容易地将外来基因复制到瞬态基因表达质粒中。同时, 通过热休克诱导, 可以对基因表达的时机进行控制。
在本报告中, 我们遵循的方法和表达三不同截断的杆状病毒基因 (细胞凋亡3, iap3 从 毒蛾 MNPV) 使用热休克为基础的瞬态蛋白表达系统和进一步应用这些表达蛋白的抗凋亡活性分析。该系统既可以快速表达国外蛋白, 又可进一步应用于 sf9 细胞蛋白质抗凋亡活性的评价, 同时也具有应用于其他蛋白质活性测定的潜力。
Protocol
Representative Results
Discussion
基于热休克的 pDHsp/V5-His/sf9 细胞系统的概念在1994年的8中首先被克莱克et描述。杆状病毒基因启动子 (IE1) 和 果蝇hsp70 的比较表明 hsp70 在蚊子细胞10中的效率更高.此外, 由于热休克诱导, 在热休克治疗后, 可以精确控制蛋白质表达的时间。该系统随后应用于虾和 nucleopolyhedrovirus (NPV) 蛋白的蛋白质功能测定9,<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢国立台湾海洋大学海洋生物学研究所宏博士提供3种质粒结构。这项研究得到了科学和技术部 (大多数) 的赠款 106-2311-B-197-001 的支持。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
