Forbigående udtryk af fremmede gener i insekt celler (sf9) for Protein funktionel analyse
Summary
Denne protokol beskriver en heat shock-induceret protein udtryk system (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system), som kan bruges til enten at udtrykke fremmede proteiner eller evaluere det anti-apoptotiske aktivitet af potentielle udenlandske proteiner og deres afkortet amino syrer i insekt celler.
Abstract
Forbigående gen expression system er en af de vigtigste teknologier til at udføre protein funktionel analyse i baculovirus i vitro celle kultur system. Dette system blev udviklet for at udtrykke fremmede gener under for baculoviral i forbigående udtryk plasmider kontrol. Dette system kan endvidere anvendes til en funktionel analyse af enten baculovirus selv eller fremmede proteiner. Mest almindeligt og kommercielt tilgængelige forbigående gen expression system er udviklet baseret på umiddelbar-tidlig gen (IE) promotor af Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Men en lav udtryk niveau af fremmede gener i insekt celler blev observeret. Derfor, en forbigående gen expression system blev bygget for at forbedre protein udtryk. I dette system, var rekombinant plasmider konstrueret til at indeholde mål sekvens under kontrol af Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promotor. Denne protokol udgør anvendelsen af dette heat shock-baserede pDHsp/V5-hans (V5 epitop med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) system; Dette system er ikke kun tilgængelig for genekspression men også for at vurdere den anti-apoptotiske aktivitet af kandidat proteiner i insekt celler. Desuden, dette system kan være enten transfekteret med en rekombinant plasmid eller co transfekteret to potentielt funktionelt antagonistiske rekombinant plasmider i insekt celler. Protokollen viser systemets effektivitet og giver en praktisk sagen om denne teknik.
Introduction
To protein udtryk systemer har været almindeligt anvendt til fremstilling af proteiner: prokaryot protein udtryk systemer (Escherichia coli gen expression system) og eukaryote protein udtryk systemer. En populær eukaryote protein udtryk system er baculovirus udtryk vektor system (BEVS)1. Baculoviruses blev først brugt som verdensomspændende biologisk kontrol agenser af landbrugs og skov skadedyr. I de sidste par årtier, var baculoviruses udviklet som bioteknologiske værktøjer til protein udtryk vektorer så godt. Genomer af baculoviruses består af dobbelt-strenget cirkulære DNA og indhyllede nucleocapsids2. Til dato har mere end 78 baculovirus blevet isolater sekventeret3. Baseret på den tidsmæssige kaskade af baculoviral gen udtryk i værtsceller insekt, kan gen transskription inddeles i fire tidsmæssige cascades, deriblandt øjeblikkelig-tidlig, forsinket-begyndelsen, slutningen og meget sent gener4.
BEVSs blev udpeget, således at de meget sent gen initiativtagere (dvs, polyeder eller p10 promotor) blev brugt til at drive mål gener, mens den rekombinante baculovirus blev genereret af homologe rekombination. Udtryk for fremmede proteiner i insekt celler af rekombinante baculovirus der ligner pattedyr proteiner i posttranslationelle modifikationer (velegnet til glycoprotein produktion). Således, at baculovirus har været udbredte5,6,7. Dog er en begrænsning tilstedeværelsen af forskellige N-glykosylering veje i insekt celler7.
Derfor blev en ny baculovirus ekspressionssystem, ekspressionssystem forbigående gen udviklet. Dette system giver udtryk for fremmede gener under kørsel af baculoviral umiddelbare-tidlig initiativtagere (dvs 1 promotor) i insekt celler. Ved hjælp af dette system, kan target proteinet være straks udtrykt under kontrol af ie-1 promotor mens du ændrer N-glykosylering pathway i insekt celler, hvilket resulterer i bedre N-linked oligosaccharider7. Desuden baculoviral umiddelbare-tidlige gener er transskriberet af cellen vært RNA polymerase II og kræver ikke nogen viral faktor for aktivering4. Derfor, fremmede proteiner kan udtrykkes i insekt celler inden for kort tid. Til dato, forbigående er gen expression system en af de vigtigste teknologier til at udføre protein funktionelle assays i baculovirus i vitro celle kultur system. Systemet kan anvendes til at analysere funktionen af enten baculovirus eller fremmede proteiner. En af de kommercielt tilgængelige forbigående gen expression systemer er baseret på umiddelbar-tidlig gen (IE) initiativtagerne til Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 og OpIE1 projektledere).
Den lavere udtryk niveau af fremmede gener i insekt celler var imidlertid stadig et problem når OpIE promotor-baserede forbigående gen expression system blev brugt8,9,10. Således, en anden forbigående gen expression system blev bygget baseret på promotor af Drosophila heat shock protein 70 (hsp70) gen8,9. Promotor af hsp70 arbejder mere effektivt end baculoviral IE promotor når induceret af heat shock i insekt celler10. I dette system, var målet gener udtrykt under kørsel af Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promotor. Fremmede gener kan klones nemt i forbigående gen expression plasmid af PCR-baseret kloning metoder. Endvidere kan foretages kontrol af timing for genekspression af heat shock induktion.
I denne betænkning, vi følger tilgangen og udtrykke tre forskellige udeladelser af baculoviral-genet (hæmmer af apoptose 3, iap3 fra Lymantria xylina MNPV) ved hjælp af heat shock-baserede forbigående protein udtryk system og yderligere gælde disse udtrykte proteiner på anti-apoptotiske aktivitet analyse. Dette system kan enten udtrykke fremmede proteiner hurtigt eller påføres yderligere evaluering af protein anti-apoptotiske aktivitet i sf9 celler, mens der også har potentiale til at blive anvendt til andre protein aktivitet assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begrebet heat shock-baserede pDHsp/V5-hans/sf9 celle system blev første gang beskrevet af Clem et al. 19948. Sammenligning af baculoviral gen promoter (IE1) og Drosophila hsp70 viste, at hsp70 havde en højere effektivitet i myg celler10. På grund af heat shock induktion, kunne timingen af protein udtryk være kontrolleret netop efter varmebehandling chok. Dette system blev derefter anvendt for protein funktionelle assays af rejer og nu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jian-Horng Leu af Marine Biologisk Institut, National Taiwan Ocean Universitet for at give 3 plasmid konstruktioner. Denne forskning blev støttet af tilskud 106-2311-B-197-001 – fra ministeriet for videnskab og teknologi (de fleste).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
