Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay
Summary
Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.
Abstract
Het voorbijgaande gen expressie systeem is een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van de functionaalanalyse eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Dit systeem werd ontwikkeld om de uitdrukkelijke buitenlandse genen onder de controle van de promotor van de baculoviral in voorbijgaande expressie plasmiden. Dit systeem kan bovendien worden toegepast op een functionele test van de baculovirus zelf of vreemde eiwitten. Het meest algemeen en commercieel beschikbare voorbijgaande gen expressie systeem is ontwikkeld op basis van de promotor van de onmiddellijke-vroege gen (IE) van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Echter werd een lage expressie niveau van buitenlandse genen in insect cellen waargenomen. Dus werd een voorbijgaande gen expressie systeem gebouwd om eiwituitdrukking te verbeteren. In dit systeem, werden recombinante plasmiden gebouwd om bevatten de volgorde van de doelgroep onder de controle van de Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Dit protocol stelt de toepassing van deze warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi (V5 epitoop met 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem; Dit systeem is niet alleen beschikbaar voor de expressie van genen maar ook voor de evaluatie van de activiteiten van de anti-apoptotic van kandidaat-eiwitten in insect cellen. Bovendien, dit systeem ofwel kan zijn transfected met één recombinant plasmide of mede twee potentieel functioneel antagonistische recombinante plasmiden in insect cellen transfected. Het protocol toont de doeltreffendheid van dit systeem en biedt een praktisch voorbeeld van deze techniek.
Introduction
Twee eiwit expressiesystemen zijn meestal gebruikt voor de productie van eiwitten: prokaryote eiwit expressie (Escherichia coli gen expressie systeem) en eukaryote eiwit expressiesystemen. Een populaire eukaryote eiwit expressie systeem is de baculovirus expressie vector systeem (BEVS)1. Baculoviruses werden voor het eerst gebruikt als wereldwijd biologische bestrijders van landbouw en bosbouw van ongedierte. In de afgelopen decennia, werden baculoviruses ontwikkeld als biotechnologische instrumenten voor eiwit expressievectoren evenals. Het genoom van de baculoviruses bestaan uit circulaire dubbelstrengig DNA en omhuld nucleocapsids2. Tot op heden meer dan achtenzeventig baculovirus geweest isolaten gesequenceerd3. Op basis van de temporele cascade van baculoviral gen expressies in insect cellen van de gastheer, kan de transcriptie van het gen worden ingedeeld in vier temporele cascades, met inbegrip van direct-vroege, vertraagd-vroege, late en erg laat genen4.
BEVSs werden aangewezen, zodat het zeer laat gene initiatiefnemers (d.w.z., veelvlak of p10 promotor) werden gebruikt om te rijden de doelgenen, terwijl de recombinante baculovirus werd gegenereerd door homologe recombinatie. Uitdrukking van vreemde proteïnen in insect cellen door recombinant baculovirus is vergelijkbaar met die van zoogdieren eiwitten in posttranslationele modificaties (geschikt voor de productie van glycoproteïne). Aldus, is de baculovirus gebruikte5,6,7. Een beperking is echter de aanwezigheid van verschillende N-glycosylation routes in insect cellen7.
Daarom werd een nieuwe baculovirus expressie systeem, het voorbijgaande gen expressie systeem, ontwikkeld. Dit systeem geeft uiting aan buitenlandse genen onder de schijf van baculoviral onmiddellijk-vroege initiatiefnemers (dwz 1 promotor) in insect cellen. Met behulp van dit systeem, kan de doel-eiwit worden onmiddellijk uitgedrukt onder de controle van ie-1 promotor tijdens het wijzigen van de route van de N-glycosylation in insect cellen, wat resulteert in betere N-linked oligosacchariden7. Bovendien, baculoviral onmiddellijke-vroege genen worden getranscribeerd door de gastheercel RNA polymerase II en vereisen geen enige virale factor voor activering4. Daarom kunnen vreemde eiwitten worden uitgedrukt in insect cellen binnen een korte tijd. Tot op heden, de voorbijgaande is gen expressie systeem een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van functionele testen van eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Het systeem kan worden toegepast om de functie van baculovirus of vreemde eiwitten te analyseren. Een van de verkrijgbare voorbijgaande gen expressiesystemen is gebaseerd op de onmiddellijke-vroege gen (IE) initiatiefnemers van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 en OpIE1 initiatiefnemers).
Het lagere niveau van de expressie van buitenlandse genen in insect cellen was echter nog steeds een probleem toen het OpIE promotor gebaseerde voorbijgaande gen expressie systeem gebruikte8,9,10. Dus, een ander voorbijgaande gen expressie systeem werd gebouwd op basis van de promotor van de Drosophila warmte schok eiwit 70 (hsp70) gen8,9. De promotor van hsp70 werkt efficiënter dan baculoviral IE promotor wanneer geïnduceerd door warmte schok in insect cellen10. In dit systeem, werden de doelgenen uitgedrukt onder het station van Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Buitenlandse genen kunnen gemakkelijk worden gekloond in het voorbijgaande gen expressie plasmide door PCR-gebaseerde klonen methoden. Bovendien is de controle van de timing voor de expressie van genen kan worden uitgevoerd door warmte schok inductie.
In dit verslag, we volgen de aanpak en uiten van drie verschillende opschoningen van het baculoviral gen (remmer van apoptosis 3, iap3 vanaf Lymantria xylina MNPV) met behulp van de warmte schok gebaseerde voorbijgaande eiwit expressie systemen en Verder gelden deze uitgedrukte proteïnen op anti-apoptotic activiteit analyse. Dit systeem kan ofwel express vreemde eiwitten snel of verder worden toegepast op de evaluatie van eiwit anti-apoptotic activiteit in sf9 cellen, terwijl ook het potentieel om te worden toegepast op andere eiwit activiteit testen te hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het concept van warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-zijne/sf9 cel systeem werd voor het eerst beschreven door Clem et al. in 19948. Vergelijking van de baculoviral gen promotor (IE1) en Drosophila hsp70 toonde aan dat hsp70 had een hogere efficiëntie in mug cellen10. Bovendien, als gevolg van de hitte schok inductie, de timing van eiwit expressie kan worden gecontroleerd juist na de schok van de warmtebehandeling. Dit systeem werd vervolgen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Jian-Horng Leu van Instituut van mariene biologie, National Taiwan Oceaan University voor het verstrekken van 3 plasmide constructies. Dit onderzoek werd gesteund door Grant 106-2311-B-197-001 – van het ministerie van wetenschap en technologie (MOST).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
