प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए कीट कोशिकाओं (sf9) में विदेशी जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक गर्मी सदमे-प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (pDHsp/V5-His/sf9 सेल सिस्टम), जो या तो विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या संभावित विदेशी प्रोटीन और उनके कटा हुआ अमीनो के विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि का मूल्यांकन कीट कोशिकाओं में एसिड होता है ।
Abstract
क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus में प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण में प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक है इन इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली । इस प्रणाली को परिवर्तनीय अभिव्यक्ति plasmids में baculoviral प्रमोटर के नियंत्रण में विदेशी जीन व्यक्त करने के लिए विकसित किया गया था । इसके अलावा, इस प्रणाली या तो baculovirus ही या विदेशी प्रोटीन की एक कार्यात्मक परख के लिए लागू किया जा सकता है । सबसे व्यापक रूप से और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली के आधार पर विकसित की है तत्काल जल्दी जीन (IE) के प्रमोटर के Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) । हालांकि, कीट कोशिकाओं में विदेशी जीन की एक कम अभिव्यक्ति स्तर मनाया गया । इसलिए प्रोटीन एक्सप्रेशन में सुधार के लिए एक क्षणिक जीन एक्सप्रेशन सिस्टम का निर्माण किया गया । इस प्रणाली में, रिकॉमबिनेंट plasmids को Drosophila हीट शॉक ७० (Dhsp70) प्रवर्तक के नियंत्रण में लक्ष्य अनुक्रम को शामिल करने के लिए निर्माण किया गया था । इस प्रोटोकॉल के आवेदन प्रस्तुत करता है इस गर्मी सदमे-आधारित pDHsp/V5-आमा (V5 epitope with 6 histidine)/धब् frugiperda सेल (sf9 cell) प्रणाली; यह प्रणाली न केवल जीन अभिव्यक्ति के लिए बल्कि कीट कोशिकाओं में उंमीदवार प्रोटीन के विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध है । इसके अलावा, इस प्रणाली या तो एक रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड या सह transfected दो संभावित कार्यात्मक विरोधी रिकॉमबिनेंट कीट कोशिकाओं में plasmids के साथ transfected जा सकता है । प्रोटोकॉल इस प्रणाली की क्षमता को दर्शाता है और इस तकनीक का एक व्यावहारिक मामला प्रदान करता है ।
Introduction
दो प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों सामांयतः प्रोटीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है: prokaryote प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (ई कोलाई जीन अभिव्यक्ति प्रणाली) और यूकेरियोट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली । एक लोकप्रिय यूकेरियोट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम (BEVS)1है । Baculoviruses पहले कृषि और वन कीट के दुनिया भर में जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया गया । पिछले कुछ दशकों में, baculoviruses प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए प्रौद्योगिकी के रूप में विकसित उपकरण थे । baculoviruses के जीनोम से मिलकर दोहरे-फंसे परिपत्र डीएनए और nucleocapsids2को ढंक दिया. तिथि करने के लिए, से अधिक ७८ baculovirus अलग अनुक्रम किया गया है3। मेजबान कीट कोशिकाओं में baculoviral जीन अभिव्यक्ति का अस्थाई झरना के आधार पर, जीन प्रतिलेखन चार अस्थाई झरने में वर्गीकृत किया जा सकता है, तत्काल जल्दी, देरी, जल्दी, देर से, और बहुत देर जीन4सहित ।
BEVSs को इसलिए नामित किया गया था कि बहुत देर से जीन प्रवर्तकों (अर्थात, polyhedron या p10 प्रवर्तक) का लक्ष्य जीन का चालन किया जाता था, जबकि रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा मुताबिक़ पुनर्संयोजन उत्पन्न किया जाता था. रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा कीट कोशिकाओं में विदेशी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बाद अनुवादात्मक संशोधनों में स्तनधारी प्रोटीन की है कि (ग्लाइकोप्रोटीन उत्पादन के लिए अनुकूल) के समान है । इस प्रकार, baculovirus व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है5,6,7। हालांकि, एक सीमा कीट कोशिकाओं में अलग एन-glycosylation रास्ते की उपस्थिति है7।
इसलिए, एक नई baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली, क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली, विकसित किया गया था । इस प्रणाली baculoviral तत्काल के अभियान के तहत विदेशी जीन एक्सप्रेस-जल्दी प्रमोटरों (ie-1 प्रमोटर) कीट कोशिकाओं में । इस प्रणाली का उपयोग करके, लक्ष्य प्रोटीन तुरंत ie-1 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जा सकता है, जबकि कीट कोशिकाओं में एन glycosylation मार्ग को संशोधित करने, बेहतर n में जिसके परिणामस्वरूप-oligosaccharides7से जुड़े । इसके अलावा, baculoviral तत्काल जल्दी जीन मेजबान सेल आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित और सक्रियकरण4के लिए किसी भी वायरल कारक की आवश्यकता नहीं है । इसलिए, विदेशी प्रोटीन एक कम समय के भीतर कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है । तारीख करने के लिए, क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus में प्रोटीन कार्यात्मक परख में प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक है इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली । प्रणाली या तो baculovirus या विदेशी प्रोटीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों में से एक तत्काल जल्दी जीन (IE) के प्रवर्तकों पर आधारित है Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 और OpIE1 प्रवर्तकों) ।
हालांकि, कीट कोशिकाओं में विदेशी जीन के निचले अभिव्यक्ति स्तर अभी भी एक समस्या है जब OpIE प्रमोटर आधारित क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली8,9,10इस्तेमाल किया गया था । इस प्रकार, एक और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली का निर्माण Drosophila हीट शॉक प्रोटीन ७० (hsp70) जीन8,9के प्रवर्तक के आधार पर किया गया । hsp70 के प्रवर्तक baculoviral IE प्रमोटर से अधिक कुशलता से काम करता है जब कीट कोशिकाओं में गर्मी सदमे से प्रेरित10। इस प्रणाली में, लक्ष्य जीन Drosophila हीट शॉक ७० (Dhsp70) प्रमोटर की ड्राइव के तहत व्यक्त किए गए थे । विदेशी जीन आसानी से पीसीआर आधारित क्लोनिंग तरीकों से क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोन किया जा सकता है । इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति के लिए समय का नियंत्रण गर्मी सदमे प्रेरण द्वारा किया जा सकता है ।
इस रिपोर्ट में, हम दृष्टिकोण का पालन करें और गर्मी सदमे आधारित क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके baculoviral जीन (apoptosis 3 के अवरोधक, iap3 से Lymantria xylina MNPV) के तीन अलग जनचेतना व्यक्त और इसके अलावा विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि विश्लेषण पर इन व्यक्त प्रोटीन लागू होते हैं । इस प्रणाली या तो विदेशी प्रोटीन जल्दी व्यक्त कर सकते है या आगे sf9 कोशिकाओं में प्रोटीन विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए आवेदन किया है, जबकि भी क्षमता होने के लिए अंय प्रोटीन गतिविधि परख के लिए लागू किया जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हीट शॉक-आधारित pDHsp/V5-His/sf9 सेल सिस्टम की अवधारणा पहले भूखों एट अल द्वारा १९९४8में वर्णित किया गया था । baculoviral जीन प्रमोटर (IE1) और Drosophila hsp70 की तुलना से पता चला है कि hsp70 मच्छर कोशिकाओं10म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम 3 प्लाज्मिड निर्माण प्रदान करने के लिए संस्थान समुद्री जीव विज्ञान, राष्ट्रीय ताइवान महासागर विश्वविद्यालय के Dr. जीआईपी-Horng लियू धंयवाद । इस अनुसंधान अनुदान 106-2311-B-१९७-001 द्वारा समर्थित किया गया था-विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सबसे) से ।
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
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