Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína
Summary
Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.
Abstract
O sistema de expressão de gene transiente é uma das tecnologias mais importantes para a realização de análise funcional da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. Este sistema foi desenvolvido para os genes expressam estrangeiros sob o controle do promotor baculoviral em plasmídeo de expressão transiente. Além disso, este sistema pode ser aplicado a um ensaio funcional de baculovirus em si ou proteínas estranhas. O sistema de expressão de gene transiente mais amplamente e comercialmente disponível é desenvolvido com base no promotor do gene imediata-início (IE) da Orgyia pseudotsugata multicapsid Membros (OpMNPV). No entanto, observou-se um nível de baixa expressão de genes estrangeiros em células de inseto. Portanto, um sistema de expressão de gene transiente foi construído para melhorar a expressão da proteína. Neste sistema, o plasmídeo recombinante foram construído para conter a sequência alvo sob o controle do promotor Drosophila calor choque 70 (Dhsp70). Este protocolo apresenta a aplicação deste calor baseada em choque pDHsp/V5-His (epítopo V5 com 6 histidina) /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular); Este sistema está disponível não só para a expressão de gene, mas também para avaliar a atividade anti-apoptotic de proteínas de candidato em células de inseto. Além disso, este sistema pode também ser transfected com um plasmídeo recombinante ou transfectadas co dois funcionalmente potencialmente antagônico plasmídeo recombinante em células de inseto. O protocolo demonstra a eficiência deste sistema e fornece um caso prático desta técnica.
Introduction
Dois sistemas de expressão da proteína tem sido comumente usados para a produção de proteínas: sistemas de expressão da proteína de procarionte (sistema de expressão de gene deEscherichia coli ) e sistemas de expressão da proteína eucariota. Um sistema de expressão de proteínas eucariota popular é a expressão de baculovirus vetor sistema (BEVS)1. Baculoviruses primeiro foram usados como agentes em todo o mundo controle biológico de produtos agrícolas e florestais pragas. Nas últimas décadas, baculoviruses foram desenvolvidas como ferramentas biotecnológicas para vetores da expressão da proteína também. Os genomas de baculoviruses consistem de DNA circular de dupla-hélice e envoltos envelopada2. Até à data, mais de setenta e oito baculovirus isolados foram sequenciados3. Baseado em cascata temporal de expressões de gene baculoviral em células de inseto hospedeiro, a transcrição do gene pode ser classificada em quatro cascatas temporais, incluindo imediata-início, início atrasado, atrasado e muito tarde genes4.
BEVSs, foram designados para que os promotores de genes muito tarde (ou seja, Poliedro ou p10 promotor) foram usados para conduzir os genes-alvo, enquanto o baculovirus recombinante foi gerado pelo recombination homologous. Expressão de proteínas extrangeiras em células de inseto pelo baculovirus recombinante é similar de proteínas de mamíferos em modificações borne-translational (adequadas para a produção de glicoproteína). Assim, o baculovirus tem sido amplamente utilizado5,6,7. No entanto, uma limitação é a presença de diferentes percursos de N-glicosilação em células de inseto7.
Portanto, um novo sistema de expressão de baculovirus, o sistema de expressão de gene transiente, foi desenvolvido. Este sistema expressa genes estrangeiros sob a unidade de baculoviral imediata-primeiros promotores (promotorou seja,-1 ) em células de inseto. Usando este sistema, a proteína do alvo pode ser imediatamente expressa sob o controle do promotor ou seja-1 ao modificar o caminho de N-glicosilação em células de inseto, resultando em melhor oligossacarídeos N-ligados7. Além disso, baculoviral imediata-primeiros genes são trascritos pela RNA polimerase II a pilha de anfitrião e não requerem qualquer fator viral para ativação4. Portanto, proteínas estranhas podem ser expressa em células de inseto dentro de um curto período de tempo. Até à data, o transitório, sistema de expressão de gene é uma das tecnologias mais importantes para a realização de ensaios funcionais da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. O sistema pode ser aplicado para analisar a função de baculovirus ou proteínas estranhas. Um dos sistemas de expressão de gene transiente comercialmente disponível é baseado nos promotores de gene início imediato (IE) de medicamentos multicapsid de Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (promotores de OpIE2 e OpIE1).
No entanto, o menor nível de expressão de genes estrangeiros em células de inseto ainda era um problema quando o sistema de expressão de gene transiente baseado no promotor OpIE foi usado8,9,10. Assim, um outro sistema de expressão de gene transiente foi construído com base no promotor da drosófila calor choque proteína 70 (hsp70) gene8,9. O promotor da hsp70 funciona mais eficientemente do que o promotor baculoviral IE quando induzida por choque térmico em células de inseto10. Neste sistema, os genes-alvo foram expressos sob a unidade de Drosophila 70 (Dhsp70) promotor de calor choque. Genes estrangeiros podem ser facilmente clonados em plasmídeo de expressão do gene transitória por métodos de clonagem baseados em PCR. Além disso, o controle de sincronismo para a expressão do gene pode ser executado por indução de choque do calor.
Neste relatório, vamos seguir a abordagem e expressar três truncamentos diferentes do gene baculoviral (inibidor da apoptose 3, iap3 de mariposa Ksýlina MNPV) usando o sistema de expressão de proteína transiente baseada em choque de calor e aplicam-se ainda mais estas proteínas expressas na análise da atividade anti-apoptotic. Este sistema também pode expressar proteínas estranhas rapidamente ou ainda ser aplicado para a avaliação da atividade anti-apoptotic de proteína nas células sf9, tendo também o potencial para ser aplicado a outros ensaios de atividade da proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
O conceito de sistema de células de pDHsp/V5-His/sf9 baseada em choque de calor foi primeiramente descrito por Clem et al em 19948. Comparação do promotor do gene de baculoviral (IE1) e Drosophila hsp70 mostrou que aquele hsp70 tinha uma eficiência mais elevada em células de mosquito10. Além disso, devido a indução de choque do calor, o momento da expressão da proteína pode ser controlado precisamente após o tratamento de choqu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Jian-Horng Leu do Instituto de biologia marinha, Universidade Nacional de Taiwan oceano para fornecer 3 construções de plasmídeo. Esta pesquisa foi apoiada por Grant 106-2311-B-197-001 – do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
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