Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas
Summary
Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.
Abstract
El sistema de expresión transitoria del gen es una de las tecnologías más importantes para la realización de análisis funcionales de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. Este sistema fue desarrollado para extranjeros expresan genes bajo el control del promotor baculovirales en plásmidos de expresión transitoria. Además, este sistema puede aplicarse a un análisis funcional de proteínas extrañas o baculovirus sí mismo. El sistema de expresión transitoria del gen más ampliamente y comercialmente disponible se desarrolla basado en el promotor de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Sin embargo, se observó un nivel de baja expresión de genes foráneos en células de los insectos. Por lo tanto, un sistema de expresión transitoria del gen fue construido para mejorar la expresión de la proteína. En este sistema, plásmidos recombinantes fueron construidos para contener la secuencia de destino bajo el control del Drosophila calor choque 70 (Dhsp70) promotor. Este protocolo presenta la aplicación de este calor basado en el choque pDHsp/V5-su (epitope V5 con 6 histidina)Spodoptera frugiperda Handy sistema (células sf9); Este sistema está disponible no sólo para la expresión de genes sino también para la evaluación de la actividad de anti-apoptotic de candidato proteínas en células de los insectos. Además, este sistema puede ser bien transfectado con un plásmido recombinante o transfected Co dos plásmidos recombinantes potencialmente funcionalmente antagónicos en células de los insectos. El protocolo demuestra la eficacia de este sistema y proporciona un caso práctico de esta técnica.
Introduction
Dos sistemas de expresión de proteínas se han utilizado comúnmente para la producción de proteínas: sistemas de expresión de proteínas de célula procariota (sistema de expresión de genes deEscherichia coli ) y sistemas de expresión de proteínas eucariotas. Un sistema de expresión de proteínas eucariotas popular es la expresión del baculovirus vector sistema (BEVS)1. Primero se utilizaron los baculovirus como agentes de control biológico en todo el mundo de la agricultura y las plagas del bosque. En las últimas décadas, baculovirus fueron desarrollados como herramientas biotecnológicas para vectores de la expresión de la proteína así. Los genomas de baculovirus consisten en ADN circular de doble hebra y envuelta nucleocápside2. Hasta la fecha, más de setenta y ocho baculovirus aislados han sido secuenciados3. Basado en la cascada de temporal expresiones baculovirales gene en las células del insecto huésped, la transcripción del gen podría clasificarse en cuatro cascadas temporales, incluyendo inmediata temprana, genes retrasado-temprano, tarde y muy tarde4.
BEVSs fueron señalados para que los promotores de genes muy tarde (es decir, poliedro o p10 promotor) fueron utilizados para conducir los genes de la blanco, mientras que el baculovirus recombinante fue generada por recombinación homóloga. Expresión de proteínas extrañas en las células de los insectos por baculovirus recombinante es similar a la de proteínas de mamíferas en modificaciones post-traduccionales (adecuadas para la producción de glicoproteínas). Así, el baculovirus ha sido ampliamente utilizado5,6,7. Sin embargo, una limitación es la presencia de diferentes vías de N-glicosilación en células de insecto7.
Por lo tanto, se desarrolló un nuevo sistema de expresión de baculovirus, el sistema de expresión transitoria del gen. Este sistema expresa genes extranjeros en la unidad de promotores inmediata temprana baculovirales (promotor deie-1 ) en células de los insectos. Mediante este sistema, la proteína diana puede expresarse inmediatamente bajo el control del promotor es decir-1 mientras modifica el camino de N-glicosilación en células de los insectos, resultando en mejor oligosacáridos N-ligados7. Por otra parte, genes inmediatos tempranos baculovirales están transcritos por la polimerasa II del RNA de la célula huésped y no requieren ningún factor viral para activación4. Por lo tanto, las proteínas extranjeras pueden expresarse en células de los insectos dentro de poco tiempo. Hasta la fecha, el transitorio sistema de expresión del gene es una de las más importantes tecnologías para realizar análisis funcional de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. El sistema se puede aplicar para analizar la función de baculovirus o proteínas extrañas. Uno de los sistemas de expresión génica transitoria disponible comercialmente se basa en los promotores de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 y OpIE1 promotores).
Sin embargo, el menor nivel de expresión de genes foráneos en células de los insectos es todavía un problema cuando el sistema de expresión de gen transitoria basada en promotor de OpIE fue usado8,9,10. Por lo tanto, otro sistema de expresión transitoria del gen fue construido basado en el promotor de la Drosophila calor choque proteína 70 (hsp70) gen8,9. El promotor de la hsp70 funciona más eficientemente que el promotor baculovirales IE cuando inducida por choque del calor en células de los insectos10. En este sistema, los genes de la blanco se expresaron bajo la impulsión de 70 (Dhsp70) promotor de Drosophila calor choque. Genes foráneos pueden clonarse fácilmente en el plásmido de expresión génica transitoria por métodos de clonación basados en PCR. Además, el control de la sincronización para expresión génica puede realizarse por la inducción del choque de calor.
En este informe, seguir el enfoque y expresar tres diferentes truncamientos del gen baculovirales (inhibidor de la apoptosis 3, iap3 de Monacha xylina MNPV) mediante el sistema de expresión de proteína de choque transitorio de calor y más se aplican estas proteínas expresadas en el análisis de la actividad anti-apoptótica. Este sistema tampoco puede expresar las proteínas extranjeras rápidamente o ser más aplicado a la evaluación de la actividad de la proteína anti-apoptótica en las células sf9, teniendo también la posibilidad de ser aplicado a otros ensayos de actividad de la proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
El concepto de calor basado en el choque pDHsp/V5-su/sf9 celular sistema primero fue descrito por Clem et en 19948. Comparación del promotor del gen baculovirales (IE1) y hsp70 de Drosophila demostraron que hsp70 tenía una eficacia más alta en células de mosquito10. Además, debido a la inducción del choque de calor, el tiempo de expresión de la proteína podría ser controlado precisamente después del tratamiento de choque de calo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. Jian Horng Leu del Instituto de Biología Marina, Universidad Nacional de mar de Taiwán para proporcionar 3 construcciones de plásmido. Esta investigación fue apoyada por Grant 106-2311-B-197-001 – desde el Ministerio de ciencia y tecnología (MOST).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
