Övergående uttryck av främmande gener i insekt celler (sf9) för Protein funktionell analys
Summary
Det här protokollet beskriver en värme chock-inducerad protein uttryck systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem), som kan användas för att uttrycka främmande proteiner eller utvärdera anti-apoptotiska aktiviteten av potentiella främmande proteiner och deras trunkerade amino syror i insekt celler.
Abstract
Systemets övergående gen uttryck är en av de viktigaste teknikerna för att utföra protein Funktionalanalys i baculoviridae i vitro cell kultur systemet. Detta system utvecklades för att uttrycka främmande gener under kontroll av baculoviral arrangören i övergående uttryck plasmider. Detta system kan dessutom tillämpas på en funktionell analys av baculoviridae själv eller främmande proteiner. Det mest allmänt och kommersiellt tillgängliga övergående gen uttryck systemet är utvecklat utifrån omedelbara-tidig genen (IE) arrangören av Orgyia pseudotsugata multicapsid nukleopolyedervirus (OpMNPV). Emellertid observerades en låg uttryck nivå av främmande gener i insekt celler. Därför konstruerades en övergående gen uttryck system för att förbättra proteinuttryck. I det här systemet konstruerades rekombinant plasmider innehåller sekvensen mål under kontroll av Drosophila värme chock 70 (Dhsp70) arrangören. Detta protokoll presenterar tillämpningen av denna värme chock-baserade pDHsp/V5-hans (V5 epitop med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) systemet. Detta system är tillgängliga inte bara för genuttryck utan också för att utvärdera anti-apoptotiska aktiviteten av kandidat proteiner i insekt celler. Dessutom detta system kan vara antingen transfekterade med en rekombinant plasmid eller samtidig transfekterade två potentiellt funktionellt antagonistiska rekombinant plasmider i insekt celler. Protokollet visar effektiviteten av detta system och ger ett praktiskt fall av denna teknik.
Introduction
Två protein uttryck system har vanligen använts för att producera proteiner: prokaryoter protein uttryck (Escherichia coli gen uttryck system) och Eukaryoter protein uttryck system. En populär Eukaryoter protein uttryck systemet är baculoviridae uttryck vector systemet (BEVS)1. Baculoviruses användes först som världen över biologiska kontrollagenter jordbruks och skog skadedjur. Under de senaste decennierna utvecklades baculoviruses som biotekniska verktyg för protein uttryck vektorer samt. Genomen hos baculoviruses bestå av dubbelsträngat cirkulär DNA och höljeförsedda nucleocapsids2. Hittills har mer än Sjuttioåtta baculoviridae har isolat sekvenserade3. Baserat på den temporal kaskaden av baculoviral genuttryck i värd insekt celler, skulle transkriptionen av gener kunna klassificeras i fyra temporal kaskader, inklusive omedelbar-tidig, försenad-tidigt, sent och mycket sena gener4.
BEVSs designerades så att mycket sent gen initiativtagarna (dvs, polyeder eller p10 arrangören) användes för att driva målet generna, medan den rekombinanta baculoviridae genererades av homolog rekombination. Uttryck för främmande proteiner i insekt celler genom rekombinant baculoviridae är liknande till det av protein från däggdjur i post-translationella modifieringar (passar för glykoprotein produktion). Baculoviridae har således varit utbredda5,6,7. En begränsning är dock förekomsten av olika N-glycosylation vägar i insekt celler7.
Därför utvecklades ett nytt baculoviridae uttryck system, övergående gen uttryck systemet. Detta system uttrycker främmande gener under drevet av baculoviral omedelbar-tidigt initiativtagare (dvs-1 arrangören) i insekt celler. Med detta system, kan målproteinet omedelbart uttryckas under kontroll dvs-1 arrangören samtidigt ändra N-glycosylation vägen i insekt celler, vilket resulterar i bättre N-länkade oligosackarider7. Dessutom baculoviral omedelbar-tidiga gener transkriberas av värdcellen RNA-polymeras II och kräver inte någon viral faktor för aktivering4. Därför, främmande proteiner kan uttryckas i insekt celler inom en kort tid. Hittills, övergående är gen uttryck system en av de viktigaste teknikerna för att utföra protein funktionella analyser i baculoviridae i vitro cell kultur systemet. Systemet kan användas för att analysera funktion antingen baculoviridae eller främmande proteiner. En av de kommersiellt tillgängliga övergående gene expression system baseras på omedelbar-tidig genen (IE) initiativtagarna till Orgyia pseudotsugata multicapsid nukleopolyedervirus (OpMNPV) (OpIE2 och OpIE1 initiativtagare).
Den lägre nivån för uttryck av främmande gener i insekt celler var dock fortfarande ett problem när OpIE arrangören-baserade övergående gen uttryck systemet var används8,9,10. Således, en annan övergående gen uttryck systemet konstruerades utifrån arrangören av Drosophila heat shock protein 70 (hsp70) gen8,9. Främjare av hsp70 fungerar mer effektivt än baculoviral IE arrangören när induceras av värme chock i insekt celler10. I detta system uttrycktes av målgener under drevet av Drosophila värme chock 70 (Dhsp70) arrangören. Främmande gener kan klonas enkelt in övergående gen uttryck plasmiden av PCR-baserade kloning metoder. Kontroll av tidpunkten för genuttryck kan dessutom utföras av värme chock induktion.
I detta betänkande, vi följer metoden och express tre olika truncations av baculoviral-genen (hämmare av apoptos 3, iap3 från Lymantria xylina MNPV) med hjälp av värme chock-baserade övergående protein uttryck systemet och vidare tillämpas dessa uttryckta proteiner på anti-apoptotiska verksamhetsanalys. Detta system kan antingen uttrycka främmande proteiner snabbt eller tillämpas ytterligare utvärdering av anti-apoptotiska proteinaktiviteten i sf9 celler, medan du också har potential att tillämpas på andra protein aktivitet analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begreppet värme chock-baserade pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem beskrevs först av Clem et al. 19948. Jämförelse av baculoviral gen arrangören (IE1) och Drosophila hsp70 visade att hsp70 hade en högre effektivitet i mygga celler10. Dessutom på grund av värme chock induktion, kunde tidpunkten för proteinuttryck styras exakt efter värmebehandling chock. Detta system användes sedan för protein funktionella analyser av räkor och nukle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Jian-Horng Leu av Institutet för marinbiologi, National Taiwan Ocean University för att tillhandahålla 3 plasmid konstruktioner. Denna forskning stöddes av Grant 106-2311-B-197-001 – från ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
