Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.
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Artigo de método
Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema de expressão de gene transiente é uma das tecnologias mais importantes para a realização de análise funcional da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. Este sistema foi desenvolvido para os genes expressam estrangeiros sob o controle do promotor baculoviral em plasmídeo de expressão transiente. Além disso, este sistema pode ser aplicado a um ensaio funcional de baculovirus em si ou proteínas estranhas. O sistema de expressão de gene transiente mais amplamente e comercialmente disponível é desenvolvido com base no promotor do gene imediata-início (IE) da Orgyia pseudotsugata multicapsid Membros (OpMNPV). No entanto, observou-se um nível de baixa expressão de genes estrangeiros em células de inseto. Portanto, um sistema de expressão de gene transiente foi construído para melhorar a expressão da proteína. Neste sistema, o plasmídeo recombinante foram construído para conter a sequência alvo sob o controle do promotor Drosophila calor choque 70 (Dhsp70). Este protocolo apresenta a aplicação deste calor baseada em choque pDHsp/V5-His (epítopo V5 com 6 histidina) /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular); Este sistema está disponível não só para a expressão de gene, mas também para avaliar a atividade anti-apoptotic de proteínas de candidato em células de inseto. Além disso, este sistema pode também ser transfected com um plasmídeo recombinante ou transfectadas co dois funcionalmente potencialmente antagônico plasmídeo recombinante em células de inseto. O protocolo demonstra a eficiência deste sistema e fornece um caso prático desta técnica.
Introdução
Dois sistemas de expressão da proteína tem sido comumente usados para a produção de proteínas: sistemas de expressão da proteína de procarionte (sistema de expressão de gene deEscherichia coli ) e sistemas de expressão da proteína eucariota. Um sistema de expressão de proteínas eucariota popular é a expressão de baculovirus vetor sistema (BEVS)1. Baculoviruses primeiro foram usados como agentes em todo o mundo controle biológico de produtos agrícolas e florestais pragas. Nas últimas décadas, baculoviruses foram desenvolvidas como ferramentas biotecnológicas para vetores da expressão da proteína também. Os genomas de baculoviruses consi....
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Protocolo
1. preparações
- Cultura de células de inseto
- Prepare-se 50 mL de meio de cultura celular. Para fazer isso, adicione 500 µ l de antibióticos (Anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL de soro de bovino fetal inactivadas pelo calor em meio de cultura celular isento de soro (sem FBS ou antibióticos).
Nota: Aquece o soro bovino fetal a 65 ° C por 30 min em um banho de água antes da utilização. - Manter a Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Arctiidae), células de inseto sf9. Desanexar ca. 80% das células do frasco de cultura 25cm2 célula agitando o balão ....
- Prepare-se 50 mL de meio de cultura celular. Para fazer isso, adicione 500 µ l de antibióticos (Anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL de soro de bovino fetal inactivadas pelo calor em meio de cultura celular isento de soro (sem FBS ou antibióticos).
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Resultados
O comprimento total e outros dois truncamentos (domínios BIR e anel) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV foram overexpressed em células sf9, baseia o calor baseada em choque pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular). O pDHsp/V5-His contido uma drosófila calor choque proteína promotora, que impulsiona a expressão gênica a jusante a uma temperatura de 42 ° C condição usando celulares fatores transcricionais e a tradução sistema (Figura 1
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Discussão
O conceito de sistema de células de pDHsp/V5-His/sf9 baseada em choque de calor foi primeiramente descrito por Clem et al em 19948. Comparação do promotor do gene de baculoviral (IE1) e Drosophila hsp70 mostrou que aquele hsp70 tinha uma eficiência mais elevada em células de mosquito10. Além disso, devido a indução de choque do calor, o momento da expressão da proteína pode ser controlado precisamente após o tratamento de choque térmico. .......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Jian-Horng Leu do Instituto de biologia marinha, Universidade Nacional de Taiwan oceano para fornecer 3 construções de plasmídeo. Esta pesquisa foi apoiada por Grant 106-2311-B-197-001 - do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antibiótico-Antimicótico, 100X | Gibco | 15240-062 | para cultura de células de insetos |
| Soro bovino fetal certificado | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | meio de cultura de células sem soro |
| Células Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 frasco de cultura de células | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Microscopia de luz invertida | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Célula Competente | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Caldo (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Ágar, Grau Bacteriológico | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | antibiótico de seleção | ant-zn-1 |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Livre de Endotoxinas) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomicina D | SIGMA | A9415 | |
| Corning tubos de centrífuga de 50 mL | SIGMA | CLS430829-500EA | tubos de 50 mL |
| Hemocitômetro | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | placa de 24 poços |
| Cellfectin II Reagente | Thermo Fisher | 10362100 | reagente de transfectina |
| de célula PBS-Phosphate-Buffered Solução salina (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4&vezes; Corante de carregamento SDS | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (membranas de blotting PVDF) | Membranas Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF |
| Mini sistema celular Trans-Blot | de | blotting | 1703930 BIO-RED |
| Solução Ponceau S | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | anticorpo |
| anti-V5 de coelhoPeroxidase de rábano IgG-rábano anti-coelho de cabra (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0,4% solução de azul de tripano | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | ||
| Symbio | PPS7 | 24 poços (19 mm&vezes; 36 milhões) |
Referências
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., M....
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Reimpressões e permissões
