Vi beskriver her stenose i den ringere vena cava som murine model af dyb venetrombose. Denne model indeholder blod flow begrænsning, en af de store udløser for venøs trombose hos mennesker.
Dyb vene trombose (DVT) og dens ødelæggende komplikation, lungeemboli, er en alvorlig sundhedsproblem med høj dødelighed. Mekanismer af blodprop dannelse i venerne forbliver uklar. Manglende mobilitet (fxefter operation eller langdistanceflyvninger) er en af de vigtigste faktorer, som fører til DVT. Den patofysiologiske konsekvens af manglen mobilitet er blod flow stagnation i venøse ventiler. Her, er en model beskrevet der efterligner forstyrrelsen flow som en trombose-kørsel faktor. I denne model oprettes delvis flow begrænsning (stenose) i den ringere vena cava (IVC). Lukningen af omkring 90% af IVC lumen for 48 h resulterer i udvikling af trombi strukturelt ligner dem hos mennesker. Lighederne er: i) det meste af Trombe volumen er rød, dvs., består af røde blodlegemer og fibrin, ii) tilstedeværelsen af en hvid led (linjer af Zahn), iii) ikke-undveg endotel éncellelag, iv) forhøjede plasmaniveauer D-Dimer og v) mulighed for at forhindre trombose af lavmolekylære heparin. Begrænsninger omfatter variabel størrelse af trombi og faktum, at en vis procentdel af wild-type mus (0 – 35%) kan ikke producere en blodprop. Ud over visuelle observation og måling, kan trombi visualiseres ved ikke-invasive teknologier, såsom ultralyd, som giver mulighed for overvågning dynamikken i Trombe udvikling. På kortere tid points (1-6 h), intravital mikroskopi kan anvendes direkte observere begivenheder (f.eks., rekruttering af celler til karvæggen) forud for blodprop dannelse. Brug af denne metode af flere teams rundt om i verden har gjort det muligt at afdække grundlæggende mekanismer af DVT indledning og identificere potentielle mål, der kan være til gavn for dens forebyggelse.
Dyb venøs trombose (DVT) er udviklingen af trombi i dybe vener, normalt (men ikke kun) i benene. I konjunktioner med lungeemboli (PE; udpeget sammen som venøs tromboemboli, VTE) det udvikler sig i cirka 900.000 amerikanerne årligt og repræsenterer et alvorligt sundhedsproblem og økonomisk problem1,2. PE, en komplikation af DVT, opstår, når en blodprop bliver løsrevet fra sin oprindelige placering og når lungerne, som kan forårsage respiratorisk insufficiens og død. Dødstal fra VTE overstiger dødelighed fra AIDS, breast cancer og trafik ulykker, kombinerede3.
Den store faktor forårsager DVT udover er kendt årsager, såsom kræft eller traume, manglen mobilitet 4,5. Dette kan skyldes kirurgi (især ortopædisk), lammelse, langdistanceflyvninger eller andre årsager. Blodgennemstrømningen i venerne afhænger muskel pumpe og derfor lemmer immobilisering resultater i stagnerende blod flyde i venøse ventiler, hvilket fører til trombose. Formålet med metoden beskrevet heri er at sammenfatte disse blod flow forvrængning6,7. Delvis flow begrænsning i den ringere vena cava (IVC) efterligner betingelser skabt i menneskelige venøs ventiler og resulterer i dannelsen af en Trombe struktur ligner af menneskelige trombi6. Den store del af en blodprop er rød og består af røde blodlegemer, fibrin og indarbejdelse af blodplader. Trombi har en lille “hvide del” beriget med blodplader (figur 1), som ligner “linjer af Zahn” beskrevet i menneskelige venøs trombi. Begge dele i blodprop indeholder også neutrofiler8, som er blandt de første celler skal ansættes i stedet for fremtidige Trombe6,9. Neutrofiler i den røde del udvise neutrofile ekstracellulære fælder (net), hvorimod neutrofiler i den hvide del synes at være net8. På samme måde til menneskelige DVT, er trombose i mus ledsaget af forhøjet plasma D-dimer niveauer (figur 2). Lavmolekylære heparin (enoxaparin), anvendes til DVT profylakse hos patienter, også forhindrer trombose hos mus. En vigtig fordel ved denne metode er fravær i endothelial denudation9, som er karakteristisk for menneskelige DVT10. Denne funktion gør IVC stenose et mere klinisk relevante model af DVT end eksempelvis induktion i blodprop af ferrichloridopløsning, som inducerer endotel denudation og hvor trombi består overvejende af blodplader11, 12,13. En model af komplet stilstand i IVC foretrækkes af flere hold14,15,16. I modsætning til stenose, hvori resterende flow vedligeholdes i fartøjet, anvendelse af stasis stopper helt flowet og dermed begrænser adgangen til systemisk administreret stoffer til webstedet trombose. Det synes også, at underliggende trombose induceret af stenose og stasis mekanismer er forskellige: stenose resulterer i udviklingen af lokale betændelse (aktivering af endothelium, frigivelse af Weibel-Palade krop indhold, rekruttering af immunceller og blodplader til karvæggen) navnlig, forårsager “immunothrombosis”6,9,17, stasis synes at fremkalde snarere trombose baseret på væv faktor og andre koagulation og fibrinolyse-relaterede mekanismer18,19,20. Således, de stenose og stasis modeller afspejler lidt forskellige aspekter af venøs blodprop udvikling, selv om deres mekanismer kan helt sikkert overlapper. Elektrolytisk IVC model (EIM) af DVT21,22 inducerer en Trombe kun delvist tilstoppe karvæggen. Derfor er det bekvemt for afprøvning af systemisk administration af forskellige lægemidler virkninger på blodprop vækst. Denne model forudsætter dog afbrydelse af IVC væg integritet (indsættelse af en nål) og induktion i blodprop af elektrisk strøm gør patofysiologiske relevansen af denne mekanisme mindst diskutable.
Her, præsenteres en protokol af IVC-stenose, der efterligner blod flow forvrængning, en vigtig udløsende faktor for DVT. Stenose af IVC inducerer udviklingen af trombi i 65-100% af C57BL/6 mus inden for 48 timer og 25-50% af mus inden for 2-6 h6,8,23 (slethvar A, upublicerede data, 2016). En stor begrænsning af metoden er variation i Trombe størrelse24 (figur 4), som er observeret efter både kortsigtede (6 h) og langsigtet (48 h) IVC stenose. Årsagerne til sådanne variation (i betragtning af at de samme betingelser, såsom spacer, anæstesi osv., der bruges) forbliver uklare, men man kan spekulere at anatomiske variationer mellem mus (f.eks., bredde IVC, antal og placering af både side og tilbage grene) ligge til grund for dette fænomen. Variation i Trombe størrelse gør trombose prævalens (procent af mus med en Trombe) Hovedresultatet. Trombose forekomsten kan sammenlignes med en kontingenstabel og det Fisher eksakt test. Et af forsøgene var en undtagelse, når reduceret Trombe størrelse med den samme trombose prævalens efter injektion af podoplanin-hæmmende antistoffer blev observeret 7.
Denne metode er især nyttig, når venøs trombose indledning er studeret. Det giver mulighed for at undersøge tidlige begivenheder i karvæggen, som rekruttering af celler, fører i sidste ende til trombose. Pro eller anti thrombotic virkningerne af narkotika kan evalueres ved hjælp af denne model med trombose prævalens er en primær udlæsning. Stenose for 48 h kan anvendes til at afsløre en anti-trombotiske fænotype, 6 h stenose kan anvendes, hvis en prothrombotic fænotype forventes. Histologiske analyse af blodprop og IVC ringmur kan også udføres.
Spørgsmålet om side grene bør være forbundet eller forlod patent forbliver åben. Den ene gruppe har vist at ligatur af sidegrene ikke øger blodprop størrelse og placering af side gren tættere end 1,5 mm til webstedet IVC ligatur dramatisk svækker Trombe udvikling25. Lukning af sidegrene kan fremkalde endotel skade i dem og også øge tid af kirurgi26. I vores hænder nedsætter manglende side gren lukning væsentligt trombose prævalens (ned til 10-30% efter 48 h stenose; Slethvar, upubliceret) og derfor vi ligate alle synlige sidegrene.
Ideelt, littermate kontrol bør anvendes som mus, selv om den samme baggrund, men fra forskellige kilder, kan have lidt forskellige trombose prævalens. Hvis effekten af DVT sig selv på nogen parametre (for eksempel, biokemiske) er undersøgt, bør sham-opererede dyr anvendes. Humbug-drives mus gennemgå samme procedure men ligatur omkring IVC lukkes løst og efterladt der uden producere stenose.
Den hyppigste fejl (et kritisk trin) i denne protokol er et forsøg på at adskille aorta og IVC ikke netop på vinklen mellem fartøjer men lidt lavere, hvilket normalt resulterer i blødning. Når en massiv blødning opstår, god genopretning af musen bliver usandsynligt og anbefales det at standse eksperimentet og aflive dyret. Normalt, mus inddrive godt, flytte inde i buret og væsentligt mister ikke vægt. Vi anbefaler at bruge mus over 20 g for både hanner og hunner og holde dyr (især hanner) i individuelle bure efter operationen indtil slutningen af forsøget at undgå kæmper og skade. Det er blevet rapporteret i en anden (elektrolytisk) model af DVT, mandlige mus producere større trombi end hunner27. Analyse af vores data har ikke afsløret væsentlige forskel i trombose prævalensen mellem mandlige og kvindelige mus (slethvar, upubliceret). Derfor opfordres forskere til at udføre eksperimenter ved hjælp af IVC stenose model på mus af begge køn.
Optrævling af suturer og/eller hæfteklammer kan ikke udelukkes, især i lange eksperimenter (en uge og længere). Således mus bør kontrolleres mindst to gange om dagen specielt til sutur integritet og en særlig opmærksomhed bør gives til udseendet af blod spor på bur sengetøj.
Det skal bemærkes, at som nogen andre dyremodel stenose af IVC har sine begrænsninger med hensyn til oversættelse til mennesker. For eksempel, har murine IVCs ikke ventiler, hvorimod menneskelige DVT udvikler inde venøs ventiler. Også, mennesker har spinal lodret med muskel pumpe er en vigtig mekanisme accelererende blodgennemstrømningen i venerne. Derimod har mus vandret spinal orientering med ingen rolle i muskel pumpe støtte blod tilbage til hjertet. Disse begrænsninger skal overvejes, når oversætte data fra musen til den menneskelige sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den britiske Heart Foundation (PG/13/60/30406) og University of Birmingham.
C57BL/6 mice | Charles River | 8 – 10 weeks old, bothe genders | |
Scissors | WPI | 15922 | |
Scissors | WPI | 14003 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
Cotton buds | Spar | ||
Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
Drapes | Kruuse | 141765 | |
Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
Microscope Olympus SZX10 | Olympus |