Перкутанная контраст Intramyocardial эхокардиография руководствуясь инъекций и доставки клеток в большой доклинических модели

Summary

Роман терапевтических стратегий в сердечной регенеративной медицины требуют обширные и подробные исследования в крупных доклинических моделях животных, прежде чем они могут рассматриваться для использования в организме человека. Здесь мы продемонстрировать технику инъекций intramyocardial эхокардиография руководствуясь перкутанная контраст в кроликов, который является ценным для гипотез эффективность такой роман терапии.

Abstract

Клеточной и генной терапии являются захватывающими и перспективных стратегий с целью регенерации сердца в параметре сердечной недостаточности с снижение фракции выброса (HFrEF). Прежде, чем они могут рассматриваться для использования и осуществляться в организме человека, обширные доклинические исследования требуются в больших животных моделей для оценки безопасности, эффективности и судьба injectate (например, стволовые клетки) раз доставлен в миокарде. Небольшой грызун модели предлагают преимущества (например, эффективность, ответственность за генетические манипуляции затрат); Однако учитывая присущие ограничения этих моделей, результаты в этих редко перевод в клинику. И наоборот, крупных животных моделей, таких как кролики, имеют преимущества (например, аналогичные сердечной электрофизиологии, по сравнению с человеком и других крупных животных), сохраняя хороший баланс экономически. Здесь мы демонстрируем как выполнить перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь intramyocardial инъекции (IMI) техника, которая является минимально инвазивной, безопасным, хорошо переносится и очень эффективны в целенаправленной доставки injectates, включая клетки, в нескольких местах в миокарде модели кролика. Для осуществления этой техники мы также воспользовались системы клинических эхокардиография широко доступны. После закапывания в практике протокол, описанные здесь, исследователя знания основных УЗИ станут компетентными в выполнении этой универсальный и минимально инвазивной техники для обычного использования в экспериментах, направленных на тестирование гипотезы возможностей сердечной регенеративной терапии в модели кролика. Как только достигается компетентности, вся процедура может быть выполнена в течение 25 мин после анестезировать кролика.

Introduction

Клеточной и генной терапии захватывающие и когда-нибудь разработки стратегий для регенерации/ремонта потерпевшего миокарда в HFrEF. В нескольких исследованиях сравнивали эффективность (например, коэффициент удержания клеток) различных маршрутов доставки клеток, которые последовательно продемонстрировали превосходство IMI над интракоронарой или внутривенного маршрутов^{1,2 , 3 , 4 , 5}. Таким образом, это не удивительно, что большая часть исследований по трансляционной модели терапии стволовой клетки потерпевшего миокарда, доставить injectate через IMI, под видом в открытой груди процедуры^6,7 . Однако этот подход имеет ряд ограничений, в том числе захватнический характер процедуры, которая несет в себе риск смертности Пери процессуального (часто занижены)⁸. Кроме того IMI под видом не устраняет возможность непреднамеренного введения в полость желудочков. В клинической практике IMI во время открытой грудной хирургии может быть соответствующий метод для доставки терапевтических клеток, например, при коронарной артерии трансплантата шунтирование (АКШ); Однако этот подход не может быть подходящим для доставки клеток в глобальной кардиомиопатия-ишемического происхождения (например, HFrEF, вторичные кардиотоксичности кардиомиопатия (AICM)).

Нет сомнений в том, что ишемическая болезнь сердца (ИБС) является наиболее распространенной причиной HFrEF (~ 66%)^9,10; однако, не ишемическая кардиомиопатия, включая AICM, по-прежнему затрагивает значительную долю больных с⁹ HFrEF (33%) . Действительно последние достижения в клинической онкологии привели к более чем 10 миллионов выживших рака в США только¹¹, с оценками аналогичное число в Европе, в соответствии с общей тенденцией к улучшение выживаемости больных раком^{12 ,13}. Таким образом изучение преимущества Роман терапии, такие как трансплантация стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия, а также испытания той эффективной и минимально инвазивной маршрут доставки стволовых клеток имеет первостепенное значение, учитывая рост числа больных пострадавших от кардиотоксичности вторичных противоопухолевых препаратов.

Следует отметить гипотез исследования с использованием клеточной терапии, направленных на ремонт/регенерации потерпевшего миокард часто предполагает использование мелких грызунов (например, мышей и крыс). Эти модели часто требуют дорогих высокой частоты ультразвуковых систем для оценки функции миокарда, обычно оборудованы с линейного массива преобразователей, которые имеют некоторые присущие связанные ограничения (например, реверберации)¹⁴. Однако другие модели, такие как кролики, представляющие большой доклинических модели, имеют некоторые преимущества для проверки гипотез при терапии стволовой клетки в HFrEF. Таким образом в отличие от крыс и мышей, кроликов поддерживать Ca^{+ 2} транспортной системы и клеточной электрофизиологии, который напоминает людей и других крупных животных (например, собаки и свиньи)^{15,16,17 ,18,19}. Еще одно преимущество, это их ответственность за сердца ультразвуковых изображений с помощью относительно недорогой и широко доступны клинических эхокардиография систем, оборудованных с относительно высокой частотой фазы массива преобразователей, например, 12 МГц, такие как те, которые часто используются в неонатальной и педиатрической кардиологии. Эти системы позволяют отличные Эхокардиографические изображений с современные технологии, и они воспользоваться превосходства гармоники²⁰изображений. Кроме того, обширные гипотеза тестирование потенциал сердечной регенеративной терапии (например, терапия стволовой клетки), их безопасность, эффективность, cardiomyogenic потенциал, а также оценки судьбы injectate раз доставлен в миокарда, является обязательным, прежде чем они могут быть рассмотрены для использования человеком, и они требуют использования больших доклинических моделях животных, как кролик^17,19. Здесь мы описываем минимально инвазивной техники для доставки клеток через перкутанная контраст эхокардиография руководствоваться IMI с помощью системы клинических эхокардиографии, которая направлена на терапии на основе трансплантации стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия²⁰ . Мы также описывают преимущества чернил Индии (InI, также известный как Китай чернил) как УЗИ контраст агента и в situ трассирующими injectate в самом сердце кролика.

Protocol

Эксперименты, описанные здесь, были утверждены Комитетом этических исследований Университета Мурсии, Испания и были проведены в соответствии с директивой 2010/63/ЕС Европейской Комиссии. Описанные шаги были выполнены под стандартные оперативные протоколы, которые являются частью плана …

Representative Results

Чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI с InI: Используя протокол описанных выше, и после того, как оптимальное расположение кончика иглы был подтвержден эхокардиографии и начало впрыска, Трансмуральное hyperechogenici…

Discussion

Основной целью было разработать минимально инвазивные техники, которые могут быть использованы для доставки стволовых клеток в миокарде кроликов (большого размера доклинические животных модель)^17,18, наслаждаясь преимуществами использования относитель…

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU