Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique et livraison de cellule dans un modèle préclinique grand

Summary

Nouvelles stratégies thérapeutiques en médecine régénérative cardiaque nécessitent des études étendues et détaillées dans des modèles animaux précliniques grands avant ils peuvent être considérés pour une utilisation chez l’homme. Ici, nous démontrons une technique d’injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique chez le lapin, qui est précieux pour l’efficacité de ces traitements novateurs des tests d’hypothèses.

Abstract

Thérapie cellulaire et génique sont passionnants et des stratégies prometteuses dans le but de la régénération cardiaque dans le cadre de l’insuffisance cardiaque avec réduit la fraction d’éjection (HFrEF). Avant de pouvoir être considérées comme devant servir et mis en œuvre chez l’humain, des études précliniques sont tenus dans des modèles animaux grands pour évaluer l’innocuité, l’efficacité et sort de l’injection de co-Set (par exemple, les cellules souches) livrée une fois dans le myocarde. Petits rongeurs modèles offrent des avantages (p. ex., rapport coût/efficacité, susceptibilité manipulations génétiques) ; Cependant, compte tenu des limitations inhérentes à ces modèles, les résultats dans ces traduisent rarement à l’infirmerie. À l’inverse, grands modèles animaux comme les lapins, ont des avantages (p. ex., électrophysiologie cardiaque similaire, par rapport aux humains et autres animaux de grande taille), tout en conservant un bon équilibre économique. Ici, nous démontrons comment réaliser une technique d’injection (IMI) de guidée par échocardiographie intramyocardique contraste percutanée, qui est peu invasive, sûr, bien toléré et très efficace dans la prestation ciblée d’injectates, y compris les cellules, dans plusieurs localités dans le myocarde d’un modèle de lapin. Pour la mise en œuvre de cette technique, nous avons également pris avantage d’un système d’échocardiographie clinique largement disponibles. Après avoir mis en pratique le protocole décrit ici, un chercheur ayant connaissance de base d’échographie va devenir compétent dans l’exercice de cette technique polyvalente et mini-invasive pour utilisation en routine dans les expériences, visant à la vérification des hypothèses de la capacités de cardiaque thérapeutique régénératrice dans le modèle de lapin. Une fois que la compétence est atteint, l’ensemble de la procédure peut être réalisée au sein de 25 min après anesthésier le lapin.

Introduction

Thérapies cellulaires et géniques sont passionnant et jamais développer des stratégies pour régénérer/réparer le myocarde blessé dans HFrEF. Quelques études ont comparé l’efficacité (p. ex., taux de rétention cellulaire) des différentes routes de livraison de la cellule, qui ont constamment démontré la supériorité de l’IMI sur routes intracoronaire ou intraveineuse^{1,2 , 3 , 4 , 5}. il n’est donc pas surprenant qu’une grande partie des études sur des modèles translationnelles de la thérapie de cellules souches du myocarde blessé, livrer l’injection co-Set via IMI réalisée sous vision directe dans un thorax ouvert procédure^6,7 . Toutefois, cette approche présente plusieurs limites, y compris le caractère invasif de la procédure, qui comporte le risque de mortalité de peri-procédure (souvent sous-déclarée)⁸. En outre, un IMI sous vision directe n’élimine pas la possibilité pour une injection accidentelle dans la cavité ventriculaire. Dans la pratique clinique un IMI au cours de la chirurgie du thorax ouvert pourrait être une méthode appropriée pour la livraison de cellules thérapeutiques, par exemple, au cours de l’artère coronaire pontage coronarien (CABG) ; de la greffe Toutefois, cette approche peut ne pas convenir à livraison de cellule cardiomyopathie global d’origine non ischémique (p. ex., HFrEF secondaire à une cardiomyopathie induite par l’anthracycline (AICM)).

Il ne fait aucun doute que cardiopathie ischémique (IHD) est la cause la plus fréquente de HFrEF (~ 66 %)^9,10; Toutefois, cardiomyopathie non ischémique, y compris AICM, touche encore une proportion importante de patients atteints de HFrEF (33 %)⁹ . En effet, les récents progrès en oncologie clinique ont donné lieu à plus de 10 millions de survivants du cancer dans les seuls Etats-Unis¹¹, avec un nombre similaire en Europe, une tendance générale vers l’amélioration de la survie des patients atteints de cancer^{12 ,},¹³. Ainsi, explorer les avantages de nouveaux traitements tels que la greffe de cellules souches pour une cardiomyopathie non ischémique, ainsi que l’essai d’un itinéraire efficace et peu invasif de la livraison de cellules souches est d’une importance capitale, étant donné le nombre croissant de patients touchés par la cardiotoxicité secondaire aux médicaments anticancéreux.

À noter, des études utilisant la thérapie de cellules souches visant à la réparation/régénérer le myocarde blessé fréquemment des tests d’hypothèses implique l’utilisation de petits rongeurs (par exemple, les souris et rats). Ces modèles nécessitent souvent des systèmes à ultrasons cher haute fréquence pour l’évaluation de la fonction myocardique, généralement équipée de transducteurs de rangée linéaire qui ont certaines limites inhérentes aux associés (p. ex., réverbération)¹⁴. Toutefois, autres modèles tels que les lapins, ce qui représente un grand modèle préclinique, ont certains avantages pour les tests d’hypothèse des traitements de cellules souches chez HFrEF. Ainsi, contrairement à des rats et des souris, lapins maintiennent un système de transport^{+ 2} Ca et électrophysiologie cellulaire qui ressemble à celle des humains et autres animaux de grande taille (par exemple, les chiens et les porcs)^{15,16,17 ,18,19}. Un autre avantage, c’est leur susceptibilité pour échographie cardiaque d’imagerie utilisant relativement peu coûteux et de systèmes d’échocardiographie clinique largement disponible équipés relativement transducteurs phase array haute fréquence, par exemple, 12 MHz, telles que ceux fréquemment utilisés en cardiologie néonatale et pédiatrique. Ces systèmes permettent l’imagerie échocardiographique excellent avec la pointe de la technologie, et ils profitent de la supériorité de harmonic imaging²⁰. Par ailleurs, des tests d’hypothèse étendue du potentiel des thérapies régénératives cardiaques (par exemple, la thérapie de cellules souches), de leur sécurité, efficacité, cardiomyogénique potentiel, ainsi que d’évaluation du devenir de l’injection de co-Set une fois délivrées dans le myocarde, est obligatoire avant elles peuvent être considérées comme à usage humain, et ils nécessitent l’utilisation de grands modèles animaux précliniques, tels que le lapin^17,19. Ici, nous décrivons une technique mini-invasive pour la livraison de la cellule via IMI contraste-échocardiographie percutanée guidée en utilisant un système clinique échocardiographie, qui vise à la thérapie à base de greffe de cellules souches non ischémique cardiomyopathie²⁰ . Nous décrivons aussi les avantages de l’encre de Chine (InI, encre de Chine, également connu sous le nom) comme un traceur échographie de contraste agent et in situ de l’injection de co-Set dans le coeur de lapin.

Protocol

Les expériences décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité éthique de la recherche de l’Université de Murcia, Espagne et ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE de la Commission européenne. Les étapes décrites ont été effectuées dans le cadre des protocoles d’exploitation standards qui faisaient partie du plan de travail et n’ont pas été effectuées uniquement dans le but de filmer la vidéo ci-jointe au présent document. 1. prépa…

Representative Results

IMI du contraste percutanée guidée par échographie avec InI : En utilisant le protocole décrit ci-dessus, et une fois le positionnement optimal de la pointe de l’aiguille a été confirmé par échocardiographie et l’injection initié, transmurale hyperechogenicity a été observée lors de la livraison de l’InI (10 % v/v dans du PBS) (Figure 2E) , aussi bien que peu de t…

Discussion

L’objectif principal était de développer une technique mini-invasive qui pourrait être utilisée pour la livraison des cellules souches dans le myocarde de lapins (un grand taille animal modèle préclinique)^17,18, tout en profitant de l’utilisation d’un relativement peu coûteux d’imagerie système facilement disponible dans de nombreuses cliniques et centres de recherche. Ici, nous montrons que, en utilisant un système d’échocardiographie cliniqu…

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU