L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande
Summary
Nuove strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa cardiaca richiedono studi estesi e dettagliati nei modelli animali preclinici grande prima che essi possono essere considerati per uso in esseri umani. Qui, dimostriamo una tecnica di iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto in conigli, che è importante per l’efficacia di tali terapie innovarici di verifica delle ipotesi.
Abstract
Terapia cellulare e genica sono interessanti e promettenti strategie ai fini della rigenerazione cardiaca nella cornice di insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione (HFrEF). Prima che possano essere considerati per l’uso e implementati in esseri umani, i vasti studi preclinici sono tenuti nei grandi modelli animali per valutare la sicurezza, l’efficacia e destino di injectate (ad es., cellule staminali) una volta consegnato nel miocardio. Piccoli roditore modelli offrono vantaggi (per esempio, costo-efficacia, disponibilità per manipolazione genetica); Tuttavia, dato le limitazioni intrinseche di questi modelli, i risultati in queste raramente si traducono in clinica. Al contrario, grandi modelli animali come conigli e presentano vantaggi (per esempio, elettrofisiologia cardiaca simile rispetto agli esseri umani ed altri animali di grandi dimensioni), pur mantenendo un buon equilibrio economico. Qui, dimostriamo come eseguire una tecnica di iniezione (IMI) intramiocardico ecocardiografia-guida percutanea contrasto, che è minimamente invasivo, sicuro, ben tollerato e molto efficace per la somministrazione mirata di injectates, compreso le cellule, in diverse posizioni all’interno del miocardio di un modello di coniglio. Per l’implementazione di questa tecnica, abbiamo anche approfittato di un sistema di ecocardiografia clinica ampiamente disponibili. Dopo aver messo in pratica il protocollo descritto qui, un ricercatore con conoscenza di base di ultrasuono diventerà competente nello svolgimento di questa tecnica mini-invasiva e versatile per uso sistematico negli esperimenti, volto alla sperimentazione di ipotesi del capacità di rigenerativa cardiaca terapeutica nel modello di coniglio. Una volta ottenuta la competenza, l’intera procedura può essere eseguita all’interno di 25 min dopo anestetizzante il coniglio.
Introduction
Terapie geniche e cellulari sono emozionanti e mai lo sviluppo di strategie per la rigenerazione o la riparazione del miocardio danneggiato in HFrEF. Alcuni studi hanno confrontato l’efficacia (ad es., tasso di ritenzione delle cellule) delle diverse vie di consegna delle cellule, che hanno sempre dimostrato la superiorità dell’IMI sulle rotte per via endovenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. così, non sorprende che gran parte degli studi su modelli traslazionale della terapia cellulare del miocardio danneggiato, consegnare il injectate via IMI eseguita sotto visione diretta in un torace aperto procedura6,7 . Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni, tra cui la natura invasiva della procedura, che comporta il rischio di mortalità peri-procedurale (spesso sotto-segnalata)8. Inoltre, un IMI sotto visione diretta non elimina la possibilità per l’involontaria iniezione nella cavità ventricolare. Nella pratica clinica un IMI durante l’ambulatorio aperto della cassa potrebbe essere un metodo appropriato per la consegna di terapeutica delle cellule, per esempio, nel corso dell’arteria coronaria di bypass coronarico (CABG); Tuttavia, questo approccio potrebbe non essere appropriato per la consegna delle cellule in cardiomiopatia globale di origine non-ischemica (ad es., HFrEF secondario a cardiomiopatia indotta da antraciclina (AICM)).
Non c’è dubbio che la malattia cardiaca ischemica (IHD) è la causa più comune di HFrEF (~ 66%)9,10; tuttavia, cardiomiopatia non ischemica, tra cui AICM, colpisce ancora una percentuale significativa di pazienti con HFrEF (33%)9 . Infatti, recenti progressi in oncologia clinica hanno provocato più di 10 milioni i superstiti di cancro negli Stati Uniti da solo11, con stime di un numero simile in Europa, coerenza con una generale tendenza verso una migliore sopravvivenza dei malati di cancro12 ,13. Così, esplorare i benefici delle terapie innovarici come trapianto di cellule staminali per cardiomiopatia non ischemica, come pure la trialing di un percorso efficace e minimamente invasivo di cellule staminali consegna è della massima importanza, dato il crescente numero di pazienti influenzato dalla cardiotossicità secondaria a farmaci antitumorali.
Da notare, gli studi che utilizzano la terapia della cellula formativa con l’obiettivo di riparazione/rigenerare il miocardio danneggiato frequentemente di verifica delle ipotesi prevede l’utilizzo di piccoli roditori (ad es., topi e ratti). Questi modelli richiedono spesso costosi ad alta frequenza ultrasuoni per la valutazione della funzione del miocardio, solitamente dotata di trasduttori di allineamento lineare che hanno alcune limitazioni intrinseche associato (ad es., riverbero)14. Tuttavia, altri modelli come i conigli, che rappresenta un grande modello preclinico, avere alcuni vantaggi per test di ipotesi di terapie con cellule staminali in HFrEF. Così, contrariamente ai ratti e topi, conigli mantengono un sistema di trasporto di Ca+ 2 e di elettrofisiologia cellulare simile a quella degli esseri umani e altri animali di grandi dimensioni (ad esempio, cani e maiali)15,16,17 ,18,19. Un altro vantaggio, è la loro disponibilità per ecografia cardiaca imaging utilizzando relativamente poco costoso e l’ecocardiografia clinica ampiamente disponibili sistemi dotati di relativamente alta frequenza fase matrice trasduttori, per esempio, 12 MHz, come quelli frequentemente utilizzati in cardiologia pediatrica e neonatale. Questi sistemi consentono un’eccellente immagine ecocardiografica con tecnologia d’avanguardia, e sfruttano la superiorità di harmonic imaging20. Inoltre, test di ipotesi ricca di potenziale delle terapie rigenerative cardiache (ad es., terapia con cellule staminali), loro sicurezza, efficacia, cardiomiogenici potenziale, nonché valutazione del destino della per iniettato una volta immessa la miocardio, è obbligatorio prima di essi possono essere considerati per uso umano, e richiedono l’uso di grandi modelli animali preclinici, come ad esempio il coniglio17,19. Qui, descriviamo una tecnica mini-invasiva per la consegna delle cellule tramite ecocardiografia di contrasto percutanea guidata IMI utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, che si rivolge a terapia a base di trapianto della cellula formativa per cardiomiopatia non ischemica20 . Inoltre descriviamo i vantaggi dell’inchiostro di India (InI, noto anche come inchiostro di China) come un ultrasuono contrasto agente ed in situ dell’elemento tracciante di injectate nel cuore di coniglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo primario era quello di sviluppare una tecnica mini-invasiva che poteva essere utilizzata per la fornitura di cellule staminali nel miocardio di conigli (un grande dimensione modello animale preclinico)17,18, traendo vantaggio dell’uso di un relativamente poco costoso imaging sistema prontamente disponibile in molte cliniche e centri di ricerca. Qui, ci mostrano che, utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, e aiutato da InI, un agente ampiame…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina per eccellente supporto fornito durante la raccolta dei dati e Carlos Bueno per fornire le cellule HEK-293 EGFP(+). Questo lavoro è stato supportato in parte dal: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spagna (JT) (concessione numero: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (Grant no. RD12/0019/0001) (JMM), co-finanziato con fondi strutturali dell’Unione europea (FESR) (JMM); e, l’Università di Reading, Regno Unito (AG, GB) (finanziamento centrale). I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
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