Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande
Summary
Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.
Abstract
Terapia celular y génica son emocionantes y prometedoras estrategias con el propósito de regeneración cardiaca en el contexto de la insuficiencia cardíaca con reducción fracción de eyección (HFrEF). Antes de que puedan ser considerados para su uso y aplicados en los seres humanos, se requieren extensos estudios preclínicos en modelos animales grandes para evaluar la seguridad, eficacia y destino de injectate (p. ej., células madre) una vez entregado en el miocardio. Modelos de roedores pequeños ofrecen ventajas (e.g., rentabilidad, receptividad para manipulación genética); sin embargo, debido a limitaciones inherentes de estos modelos, rara vez se traducen en la clínica de los resultados en estos. Por el contrario, los modelos animales grandes como conejos, tienen ventajas (e.g., electrofisiología cardíaca similar en comparación con los seres humanos y otros animales grandes), manteniendo un buen equilibrio rentable. Aquí, demostramos cómo realizar una técnica de inyección (IMI) percutánea contraste intramiocárdico guiada por ecocardiografía, que es mínimamente invasivo, seguro, bien tolerado y muy efectivo en la entrega específica de injectates, incluidas las células, en varios lugares en el miocardio de un modelo de conejo. Para la aplicación de esta técnica, también hemos tomado ventaja de un sistema de ecocardiografía clínica ampliamente disponibles. Después de poner en práctica el protocolo descrito aquí, un investigador con conocimientos de ecografía básica será competente en el desempeño de esta técnica mínimamente invasiva y versátil para uso rutinario en los experimentos, a la comprobación de la hipótesis de la capacidades de la terapéutica regenerativa cardiaca en el modelo de conejo. Una vez que se logra la competencia, todo el procedimiento se puede realizar dentro de 25 minutos después de la anestesia en el conejo.
Introduction
Las terapias celular y génica son emocionantes y nunca desarrollar estrategias para la regeneración o reparación del miocardio lesionado en HFrEF. Unos pocos estudios han comparado la eficacia (e.g., tasa de retención celular) de las diferentes rutas de entrega de la célula, que constantemente han demostrado la superioridad del IMI sobre rutas intravenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. por lo tanto, no es de extrañar que una gran proporción de los estudios sobre modelos traslacionales de la terapia de la célula de vástago del miocardio lesionado, entregar el injectate via IMI realizada bajo visión directa en un pecho abierto procedimiento6,7 . Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones, incluyendo la naturaleza invasiva del procedimiento, que conlleva el riesgo de mortalidad peri-procedimiento (a menudo debajo-divulgado)8. Además, un IMI bajo visión directa no elimina la posibilidad de que la inyección inadvertida dentro de la cavidad ventricular. En la práctica clínica un IMI durante cirugía abierta de tórax podría ser un método adecuado para la entrega de la terapéutica celular, por ejemplo, en la arteria coronaria bypass cirugía del injerto (CABG); sin embargo, este enfoque no puede ser apropiado para la entrega de celular global miocardiopatía de origen no isquémico (p. ej., HFrEF secundaria a miocardiopatía inducida por antraciclinas (AICM)).
Cabe duda de que la cardiopatía isquémica (IHD) es la causa más común de HFrEF (~ 66%)9,10; sin embargo, la cardiomiopatía no isquémica, incluyendo AICM, todavía afecta a una proporción significativa de pacientes con HFrEF (33%)9 . De hecho, los recientes avances en oncología clínica han resultado en más de 10 millones de supervivientes de cáncer en los Estados Unidos solo11, con las estimaciones de un número similar en Europa, consistente con una tendencia global hacia la mejoría en la supervivencia de pacientes con cáncer12 ,13. Por lo tanto, explorar los beneficios de los nuevos tratamientos como el trasplante de células madre para la cardiomiopatía no isquémica, así como las pruebas de una ruta efectiva y mínimamente invasiva de la entrega de la célula de vástago es de suma importancia, dado el creciente número de pacientes afectados por cardiotoxicidad secundaria a medicamentos contra el cáncer.
De nota, usando terapia de células madre con el objetivo de reparación/regenerar el miocardio lesionado con frecuencia los estudios de prueba de hipótesis consiste en el uso de roedores pequeños (por ejemplo, ratones y ratas). Estos modelos requieren a menudo sistemas de ultrasonido de alta frecuencia costosos para la evaluación de la función miocárdica, generalmente equipada con transductores de arreglo lineal que tienen algunas limitaciones inherentes asociadas (e.g., reverberación)14. Sin embargo, otros modelos como los conejos, que representan un gran modelo preclínico, tienen algunas ventajas para la comprobación de hipótesis de terapias con células madre en HFrEF. Así, en contraste con las ratas y ratones, conejos mantienen un sistema de transporte de Ca+ 2 y electrofisiología celular que se asemeja a el de seres humanos y otros animales grandes (por ejemplo, perros y cerdos)15,16,17 ,18,19. Otra ventaja es su receptividad para ultrasonido cardiaco proyección de imagen usando relativamente baratos y los sistemas de ecocardiografía clínica ampliamente disponible equipados con transductores array relativamente para fase de alta frecuencia, por ejemplo, 12 MHz, tales como los utiliza con frecuencia en cardiología pediátrica y neonatal. Estos sistemas permiten excelente imagen ecocardiográfica con tecnología de vanguardia, y toman ventaja de la superioridad de la proyección de imagen20armónica. Además, comprobación de hipótesis amplia de las posibilidades de terapias regenerativas cardiacas (p. ej., terapia de células madre), su seguridad, eficacia, cardiomiogenético potencial, así como evaluación del destino de la injectate una vez entregado en el miocardio, es obligatorio antes de que se pueden considerar para el uso humano, y requieren el uso de modelos animales preclínicos grandes, tales como el conejo17,19. Aquí, describimos una técnica mínimamente invasiva para la entrega de la célula mediante ecocardiografía de contraste percutánea guiada por IMI utilizando un sistema de ecocardiografía clínica, destinada a terapia basadas en el trasplante con células madre para la cardiomiopatía no isquémica20 . También describimos las ventajas de la tinta de la India (InI, también conocido como tinta China) como un trazador ultrasonido contraste agente y en situ de injectate en el corazón de conejo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo principal era desarrollar una técnica mínimamente invasiva que podría ser utilizada para la entrega de células madre en el miocardio de conejos (un gran tamaño animal modelo preclínico)17,18, mientras que tomando ventaja de la utilización de un relativamente barato, fácilmente disponible en muchas clínicas del sistema de imagen y centros de investigación. Aquí, demostramos que, utilizando un sistema de clínicas de la ecocardiografía, y ay…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen excelente apoyo brindado durante la recogida de datos y Carlos Bueno para proporcionar las células HEK-293 EGFP(+) Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz y Manuel Molina. Este trabajo fue financiado en parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, España (JT) (número de autorización: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (no de la concesión. RD12/0019/0001) (JMM), cofinanciado con fondos estructurales de la Unión Europea (FEDER) (JMM); y la Universidad de Reading, Reino Unido (AG, GB) (financiación Central). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
Materials
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
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